- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
Из всего выше сказанного видно, что рекомбинантный фактор роста нервов обладает огромным фармацевтическим потенциалом для терапии нейродегенеративных заболиваний центральной и периферической нервной систем, а также для ряда других патологических состояний, связанных с иммунной системой. Тем не менее, рекомбинантный NGF не является коммерчески доступным в качестве лекарственного средства. Существенным препятствием на пути создания лекарственных препаратов на основе NGF является труднодоступность данного белка. С одной стороны, эти белки практически невозможно выделить из природных источников. С другой стороны, биологически активный фактор роста нервов сложно получить в гетерологичных экспрессионных системах [].
На первых этапах для продукции NGF как правило, использовались эукариотические экспрессионные системы, которые характеризуются низким выходом целевого белка . Так в 1990 году С. Сюдерстром с соавторами встроили рекомбинантный NGF в COS клетки зеленой мартышки. При этом выход составил 1 мкг/мл []. В 2000 году И. Шелли с соавторами описал получение рекомбинантного человеческого NGF используя клетки насекомых, в качестве переносчика белка служил бакуловирус []. В 2007 году Муркин Е. В. получил линии мух D.melanogaster, содержащие ген красного флуоресцентного белка (DsRed) и ген фактора роста нервов (ngf) под контролем промотора белка теплового шока HSP70 D.melanogaster. Было показано, что при кокультивации со срезом мозга крыс клетки этих линий выживают и продуцируют трансгенный белок как минимум два дня. NGF, экспрессируемый клетками трансгенной линии D.melanogaster, кокультивированными со срезом мозга крыс усиливает рост и изменяет морфологию нейральной ткани (в том числе ускоряет образование связей между нервным клетками хозяина и кокультивированными клетками) [] В 2006 году была описана продукция rhNGF в Eisenia Foelida (WO/2006/082609 выделение человеческого NGF-подобного белка из Eisenia foelida и его использование). Данный метод очень сложный и труднореализуемый в промышленных масштабах, поскольку он требует выращивания Eisenia foelida (несколько особей), для этого необходима дорогостоящая система для выращивания и кольчатых червей, кроме того сам процесс подготовки кольчатых червей (прежде чем приступить к добыче рекомбинантного белка) трудоемкий и требует больших временных затрат. Кроме того при использовании животных для производства белка требуется строго соблюдать стерильность системы технического обслуживания, что не позволяет осуществлять непрерывное производство белка. Также RhNGF был получен в клетках насекомых (Barnettetal. J. Neuroehem. 57,1052-1061 1991, USPat. Номер 5272063) и в клетках млекопитающих (Iwane et al.Biochem, Biophys. Res Com/mm. 171,116-122, 1990; U.S.Pat. No. 5,639,664; Grey, Genetech U.S. Pat. No. 5,288,622) с лучшими результатами при получении in vitro биологически активных рекомбинантных белков.
Предложено несколько систем для производства NGF в растениях (описаны потенциально возможные системы, без каких-либо доказательств реальной продукции), эти системы предполагают использование генноинженерных семян однодольных растений, таких как рис, ячмень, пшеницы, сорго (US2004/0078851 Производство человеческого фактора роста в семенах однодольных растений). В 2011 году итальянскими учеными был предложена работа с использованием семян двудольных растений, таких как табак для экспрессии фактора роста нервов.
В последнее время все более популярные стали прокариотические экспрессионные системы, так как они являются экономически выгодными и позволяют получить больше белка. Анализ литературных источников показывает различные способы получения значительного количества биологически активного рекомбинантного человеческого NGF (rhNGF) с использованием клеток Escherichia coli. Элени Дикоу в 1992 году описала метод, при котором в кишечной палочке NGF накапливался в виде телец включения. Дальнейший рефолдинг и очистка позволила получить около 7 мг/мл белка 95% чистоты, биологическая активность которого проверялась на культуре симпатических ганглиев 9 дневных куриных эмбрионов и оказалась в 50 раз меньше мышиной NGF, что может быть связанно с неправильным образованием дисульфидных связей внутри молекулы []. В 2011 году Л.М. Рафиева с соавторами осуществилf экспрессию proNGF в клетках Escherichia coli. BL-21 (DE3). При последуещем рефолдинге и очистке им удалось получить биологически активный биолог 80 % чистоты с конечной концентрцией 35-45 мкг/мл [].