2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
Этапы получения гибридной последовательности SumoNGF представлены на рисунке _ . На первом этапе c помощью ПЦР была накоплена ДНК фрагментов NGF и SUMO. В качестве матрицы для накопления гена NGF брали заранее полученную плазмиду pTNGF и использовали прямой праймер NG и обратный праймер Sp6 (ПЦР №1). В качестве матрицы для накопления гена SUMO брали плазмиду pTS и использовали прямой праймер T7 и обратный праймер SU (ПЦР №2). Благодаря специально подобранным праймерам каждый фрагмент имеет выступающий не амплифицирующийся конец, которые комплементарны друг другу. На втором этапе ставили ПЦР №3. В качестве матрицы брали полученные фрагменты SUMO и NGF и используя прямой праймер Т7 на SUMO и обратный праймер на NGF.В результате комплементарного взаимодействия двух последовательностей получили фрагмент SumoNGF, который в дальнейшем использовался для создания экспрессионной конструкции.
Рисунок _. - Этапы получения гибридной последовательности SumoNGF
2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
Экспрессионная плазмида для гибридной экспрессии собиралась аналогично первой конструкции. Полученную вышеуказанным способом последовательность гена гибридного белка с SUMO проклонировали по сайтам рестрикции NdeI и XhoI.в плазмиду pGEMEX1. Лигазную смесью, трансформировали компетентные клетки штамма XL1-Blue. Затем трансформированные клетки высевали на агаризованную среду YT с ампициллином, в качестве селективного агента
Основные этапы для сборки векторной конструкции pTSumoNGF представлены на рисунке_
Рисунок _. - Основные этапы сборки векторной конструкции pTSumoNGF.
1
2 3 4 5 6 7 8 9
10 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Рисунок _ - ПЦР – скрининг бактериальных клонов.
1, 12 – ДНК маркер, 2-10,13 -21 - плазмидная ДНК бактериальных клонов № 1-18, 11, 22 - положительный контроль, фрагмент NGF.
Бактериальные клоны анализировали на содержание нужного фрагмента быстрым ПЦР-скринингом, используя праймеры SMseq и Sp6 на начало и конец последовательности SumoNGF (Рисунок _ ).
Результаты скрининга показали, что у всех клонов кроме №14 и №18 наработался фрагмент теоретически рассчитанного размера (Рисунок _ ). Это говорит о том что лигирование прошло правильно Для дальнейшего исследования было отобрано 10 клонов (№ 1, 2, 6, 7, 9, 10 , 11, 13, 15, 17 ). Плазмиды отобранных клонов анализировали с помощью рестриктного анализа по сайтам рестрикции
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12
Рисунок _ . – Рестрикционный анализ плазмиды pTSumoNGF
1. –ДНК маркер, 2 -11. - рестрикционный анализ плазмид клонов № 1, 2, 6, 7, 9, 10 , 11, 13, 15, 17 соответственно, 12. – положительный контроль плазмида pGEMEX1.
Перечисленные бактериальные инокулировали в 3 мл YT среды и выращивали в течение ночи при 37оС в стерильных пробирках на 15 мл. С 3 мл. ночной культуры была собрана биомасса и выделена плазмидная ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Полученные векторные конструкции № 1, № 2, №6, № 7, № 9 были отданы в Межинститутский Центр коллективного пользования “ГЕНОМ” Центр “Биоинженерия” РАН. Правильность последовательности ДНК гена SumoNGF и сопутствующих областей в плазмиде была подтверждена секвенированием (Приложение _ )