- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
Плазмидную ДНК поддерживали в штамме XL1-Blue. С селективных сред на чашках Петри с трансформированными клетками снимали в стерильных условиях 1 колонию и помещали ее в пробирку (15 мл) со средой YT (3 мл), содержащую ампициллин. Клетки культивировали в течение ночи при 370 С в термостате с умеренным перемешиванием (250 об/мин). Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием наборов реактивов фирм QIAGEN (Германия). Все манипуляции осуществляли согласно протоколу фирмы изготовителя. Выход ДНК с 3 мл ночной культуры составлял примерно 20 мкг.
1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
Готовили 20 мл реакционной смеси, содержащей 1 ед. Taq-полимеразы, 1х буфер для Taq-полимеразы, 0,2 мМ нуклеозидтрифосфаты (dNTPs), 1 мкМ каждого из праймеров. Пластиковым наконечником собирали часть колонии, которая нуждалась в проверке, и суспендировали в реакционной смеси. Дальше проводили ПЦР на приборе «Mastercycler personal» («Eppendorf», Германия) по следующей схеме: предварительный цикл прогрева в течение 5 минут при 96°С и циклов амплификации 30. Один цикл амплификации включал в себя денатурацию ДНК при 95ºС (30 сек), отжиг (30 сек) и элонгацию при 74ºС. Результаты фиксировались электрофорезом в агарозном геле.
1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования “ГЕНОМ” Центр “Биоинженерия” РАН, с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).
1.9.10 Быстрая трансформация.
Готовили ночную культуру штамма, который необходимо трансформировать. Использовали для этого пробирку на 15 мл. Объем культуры – не более 3 мл, среда - YT. Выращивали на качалке при 250 об/мин и 37°С 16 часов. К 3 мл свежей YT среды в пробирке на 15 мл добавляли 30 мкл ночной культуры и выращивали на качалке при 37°С и 250 об/мин в течение 2-3 часов до достижения плотности культуры 0.6 – 0.9 о.е. при 550 нм. Переносили 1 мл культуры в стерильную пробирку Eppendorf. Центрифугировали при 12.000 g в течение 1 мин. Супернатант сливали. Центрифугировали пробирку при 12.000 g в течение 15 сек. Тщательно удаляли остаток супернатанта. К клеточному осадку добавляли 100 мкл раствора для трансформации и суспендировали. Затем инкубировали во льду 5 мин. Добавляли раствор плазмидной ДНК (~10 нг в объеме 1-5 мкл) и инкубировали во льду в течение 8 мин. Далее проводили heatshock: пробирку с клетками инкубировали 30 секунд в термостате при температуре 42С и затем помещали на 2 минуты в лёд. После добавляли 900 мкл среды YT и инкубировали при 37С в термостате с перемешиванием (550 об/мин) 1 час. После высевали 50 мкл суспензии на чашки с агаризованной средой и антибиотиком. Концентрации антибиотика: ампициллин – 50 мг/л. Инкубировали при 37°C в течение ночи.
1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
Для выращивания бактерий использовали автоиндукционную среду 2ZYM – 5052 и среду TB - 5052 . В среды добавляли антибиотик в концентрации 100 мкг/мл и помещали в колбы из расчета 10 мл среды на 100 мл колбу. Среды заражали колониями, собранными с чашек, содержащих YT-агар с антибиотиками, из расчета 3 колонии на 1 мл питательной среды. Далее колбы инкубировали при 37ºС , перемешивая (300 об/мин) в течение 24 часов.