1.7 Ферменты

В работе были использованы эндонуклеазы рестрикции фирм New England Biolabs (США), Fermentas (Литва); ДНК-лигаза фага Т4 Fermentas (Литва); термостабильная PfuI ДНК-полимераза (Promega, США); термостабильная KAPA2G-HiFi ДНК-полимераза (Kapa biosystems, США).

1.7 Реактивы и наборы реактивов

Для приготовления питательных сред были использованы: бакто – триптон, дрожжевой экстракт, глицерин, глюкоза, лактоза (Panreac Испания). Антибиотики: ампецилин и хлорамфеникол (GmbH ,Германия). Реактивы для приготовления буферов: дигидрофосфат калия (натрия), гидрофосфатдикалия (динатрия), хлорид натрия (калия), трис-HCl, SDS, Triton X-100 производства фирмы Panreac (Испания); ЭДТА, β-меркаптоэтанол, DTT, HEPES производства фирмы Sigma-Aldrich (Германия). Реактивы для электорофоретического разделения ДНК агароза, бромистый этидий фирмы Helicon (Россия), борная кислота (Россия), ДНК маркер SM 1331 Fermentas(Литва);. Реактивы для иммунодот-блота наборы антител против гистидинового тага, против константной части антител гистидинового тага с щелочной фосфатазой, субстратами NTB, BCIP-T производства Sigma (Германия), Твин 20 фирмы Panreac (Испания). Прочие: DMSO, ацетат натрия производства Panreac (Испания); PMSF, биотин производства Appli Chem (Германия); изопропанол-2, этанол, хлороформ, фенол фирмы Merck (Германия).

Набор реактивов для выделения и очистки ДНК: QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия), GelElutePlasmid Miniprep Kit (Sigma, США).

1.8 Растворы и буферы.

Буфер для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот:

развести в 20 раз водой ТВЕ. Добавить 50 мкл на литр этидий бромида.

Краска для нанесения в агарозный гель:

2,7 мл (3,4 г) глицерина, 0,3 мл 10  ТВЕ буфер, 100 мкл 10% SDS, 1 мл 0,5 М ЕДТА, 0,9 мл воды, 1 мг бромфенолового голубого.

Приготовление маркера для электрофореза:

смешать 100 мкл краски для нанесения в агарозный гель, 100 мкл маркера λ/HindIII фрагментов ДНК и 400 мкл воды.

Приготовление смеси фенол-хлороформ:

отфасовать в сцинтилляционный флакон равные объемы хлороформа и нейтрализованного фенола; поместить туда же небольшое количество верхней водной фазы от нейтрализованного фенола;

Приготовление 100 мМ раствора PMSF:

растворить PMSF в изопропаноле в концентрации 17.4 мг/мл. Хранить раствор при -20°С.

Трис-боратный буфер (х10), рН 8.8 (ТВЕ):

смешать 108 г Трис, 55 г борной кислоты, 9.3 г ЕДТА. Долить воды до 1 л (рН 8.3-8.6 подводить не нужно). Профильтровать через фильтр 0.62 микрона.

Трис-ацетатный буфер (х50) (ТАЕ):

смешать 242 г Трис, 57 мл уксусной кислоты и 100 мл 0.5 М ЕДТА, рН 8.0. Довести объем до 1 л водой.

Приготовление рвs буфера (х10):

растворить 80 гNaCl, 2 гKCl, 14.4 г Na₂HPO₄, 2.4 г KH₂PO₄ в 800 мл воды. Довести рН до 7.4 концентрированной HCl. Довести объем до 1 л.

TES-буфер:

10 мМ Трис, рН 6.8, 1 мМ ЕДТА, 2 % SDS.

70% спирт:

79,2 мл (63.33 г) 96% этанола смешать с 23,33 мл воды MilliQ

1 М Трис-HCl:

растворить 121 г Трис (основание) в 800 мл воды. Подвести до необходимого рН концентрированной соляной кислотой. Довести объем до 1 л водой. Профильтровать через мембрану с диаметром пор 0.2-0.45 микрона.

5 М NaCl:

растворить 292 г NaCl в 1 л воды. Профильтровать через мембрану с диаметром пор 0.2-0.45 микрона.

5 М NaОН:

растворить 400 г NaOH в 1 л воды.

Буфер для фракционирования белков:

Тритона X-100 0.1%, PMSF 0.1 мМ , EDTA 1 мМ

Cтоковые растворы для приготовления электрофорезного геля:

Раствор акриламида 30%, 29:1, 1М Трис-HCl, pH 8.8, 1М Трис-HCl, pH 6.8, 10% SDS, 10% раствор APS

Электродный буфер:

0.025М Tris-HCl, 0.192 М Глицин, 0.1% SDS, pH 8.3

2х-кратная краска для нанесения на белковыйфорез:

0.125 М Tрис-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% v/v глицерин, 10% 2-меркаптоэтанол, 0.02% бромфеноловый синий, pH 6.8

Фиксирующий раствор: