- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
Реферат
Исупов С. В. Фактор роста нервов человека: Гетерологичная экспрессия гена бета NGF в клетках E. coli и разработка методов выделения и очистки белка фармокопейного качества. / Центр ”Биоинженерия РАН”, лаборатория готовых лекарственных форм: рук. к.б.н. Шульга А. А. – Москва, 2012. − 181 с., 40 рисунков, 29 таблиц, 67 источников, 10 приложений.
НЕЙРОТРОФИНЫ, ФАКТОР РОСТА НЕРВОВ (NGF), P75 - РЕЦЕПТОР, TRK - РЕЦЕПТОР, НЕЙРОНЫ, ДНК, ТРАНСФОРМАЦИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА.
Объект исследования – рекомбинантный человеческий фактор роста нервов (hrNGF)
Цель дипломной работы – получение биологически активного hrNGF человека путём бактериального синтеза в клетках Escherichia coli.
Сконструированы гибридная система экспрессии hrNGF, в которой в качестве белка партнёра выступал белок SUMO. Гибридный белок получали в штамме E. coli BL-21(DE3) в количестве 1 г/л культуры в виде «истиных» телец включения. С целью повысить выход белка при культивировании были оптимизированы режимы температуры, время и состав среды. Полученный гибридный белок, а в дальнейшем целевой белок очищали с помощью ионообменной хроматографий. Активность hrNGF определяли в экспериментах по in vitro связыванию с внеклеточным доменом рецептора p75. В результате проделанной работы был разработан эффективный и простой метод получения высокоочищенного активного hrNGF с выходом 5 мг/л клеточной суспензии.
Введение
Фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF) представляет собой небольшой секретируемый белок семейства нейротрофинов. Этот белок синтезируется в клетке в форме пробелка, который кроме участка, соответствующего зрелому фактору, содержит сигнальный пептид и пропептид. Он кодируется у человека геном NGF на коротком плече 1-й хромосомы Впервые его деятельность была обнаружена итальянским нейробиологом Леви-Монтальчини в опухолевых тканях в 1950 году, за что она в 1986 году получила Нобелевскую премию по физиологии и медицине.
NGF регулирует выживаемость симпатических и сенсорных нейронов периферической нервной системы, а также холинергических нейронов ЦНС Кроме того, ФРН влияет на выделение медиаторов (ацетилхолина, глутамата и др.) в нервно-мышечных синапсах и синаптосомах гиппокампа.
Фактор роста нервов является белком, определяющим развитие симпатической нервной системы, благодаря стимуляции нервных клеток. NGF, взаимодействуя со своими рецепторами, отвечает за запуск множества метаболитических путей внутри клетки, тем самым обладая большим терапевтическим потенциалом для лечения болезней в которых задействованы эти пути.
Современные знания о данном белке позволяет его использовать при коррекции и лечение заболеваний центральной нервной системы, связанных с психическими расстройствами (слабоумие, депрессия, шизофрения, аутизм, синдром Ретта, анорексии и булимии, болезни Альцгеймера). Кроме того он играет важную роль в сердечно – сосудистых заболеваниях (атеросклероз коронарных артерий, ожирение, сахарный диабет 2 типа). Существует доказательство того, что NGF может быть полезен в лечении кожных язв и язв роговицы.
Все выше сказанное говорит о том, что создание лекарственных препаратов на основе фактора роста нервов является социально значимой проблемой. Данный белок практически невозможно выделить из природных источников. Поэтому перспективным является получение биологически активного фактора роста нервов в гетерологичных экспрессионных системах. Анализ литературы по данной проблеме показывает небольшое количество информации, что говорит об актуальности и перспективе получения рекомбинантного NGF.
Целью данной работы является получение высокоочищенного фактора роста нервов человека путём бактериального синтеза в клетках Escherichia coli для дальнейшего использования в фармацевтических целях.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Получение векторной конструкции, обеспечивающей экспрессию гибридного белка hrSNGF в клетках Escherichia coli.
Получение штамма-продуцента и подбор условий культивирования.
Очистка гибридного а в дальнейшем целевого белка hrNGF.
Дипломная работа выполнена в лаборатории готовых лекарственных форм Центра «Биоинженерия» РАН