Получение экспрессионного вектора pCbd-vegf165.

Ранее полученный ген человеческого VEGF₁₆₅ был амплифицирован при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Xho I, в качестве матрицы использовали плазмиду pTVG-VEGF₁₆₅.

Амплифицированый ген hVEGF₁₆₅ был клонирован по сайтам Xho I и Bgl II в ранее созданную для этого генетическую конструкцию pET-CBD. В результате получили плазмиду pCBD-VEGF₁₆₅ (Рис. 21).

Рис.21. Схема получения плазмиды pCBD-hVEGF₁₆₅.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER 2566, которые затем рассеивали на твёрдой питательной среде, с целью отбора клонов. В результате было проверенно 9 клонов на наличие экспрессии гибридного белка (Рис. 22).

Рис.22. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/pCBD-hVEGF₁₆₅. Где А – гибридный белок CBD-hVEGF₁₆₅.

Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы (в компании Евроген).

Из биомассы клона №4 была выделена плазмида pCBD-VEGF₁₆₅ для дальнейшей работы.

Получение штамма продуцента гибридного белка cbd-vegf165.

Выделенной плазмидой pCBD-VEGF₁₆₅ трансформировали клетки E. coli Origami (DE3). Полученный штамм продуцент проверяли на наличие продукции гибридного белка. Элетрофорез проводили в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях с целью обнаружения димера гибридного белка. Электрофореграмма в невосстанавливающих условиях показала наличие димера химерного белка (Рис. 23). Целевой белок после ультразвуковой дезинтеграции биомассы клетки E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ в основном присутствовал в растворённой фракции. Таким образом, нам удалось избежать образования телец включения, характерных для гетерологической экспрессии многих белков в клетках E. coli.

Рис. 23.Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, B- мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅.

Подбор условий культивирования штамма e. Coli Origami (de3)/pCbd-vegf165

В ходе дальнейшей работы был проведен подбор оптимальных условий культивирования штамма-продуцента. Для этого в процессе культивирования клеток после добавления ИПТГ каждый час отбирались пробы биомассы. Культивирование проводили при 30^о С.

Результаты данного эксперимента представлены на рис. 24.

Рис. 24. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) образцов биомассы E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF₁₆₅после индукции ИПТГ. Где А – гибридный белок CBD-VEGF_165.

Из полученной электрофореграммы видно, что оптимальное время культивирования клеточной культуры E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ 15-16 часов после добавления ИПТГ.

Выделение и очистка гибридного белка cbd-hVegf165.

Полученный продуцент E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ культивировали при 37 ⁰С до оптической плотности 0,6-0,7, затем добавляли ИПТГ и выращивали при 30 ⁰С в течении 16 часов.

Биомассу штамма-продуцента E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ подвергали ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Используя сродство VEGF₁₆₅ к гепарину, гибридный белок, содержащийся в осветлённом лизате, очищали от белков E. coli на колонке HiTrap HP Heparin-Sepharose. Полученные фракции анализировали на наличие димера гибридного белка с помощью SDS-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих условиях.

Рис. 25. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы. Где A – димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅. B – мономер гибридного белка CBD-hVEGF_165.

По результатом электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.

Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией на мембране YM 30 с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка TEV-протеазой.

Протеолитическое расщепление гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅ TEV протеазой.

Концентрат нанесли на колонку, заполненную хитиновым сорбентом (New England Biolabs). Колонку заполнили буферным раствором, содержащим TEV протеазу, инкубировали при 37^оС на 15 часов. Продукты протеолитического расщепления элюировали буферным раствором А. Элюат и хитиновый сорбент анализировали методом SDS-электрофорезом.

Рис 26. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка на колонке заполненной хитиновым сорбентом. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, B – мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, C – hVEGF ₁₆₅.

Эффективность ферментативного гидролиза составила менее 50%. В качестве альтернативного пути осуществления протеолитического расщепления ГБ было решено отказаться от предварительной сорбции на хитиновый сорбент, а расщеплять, непосредственно, в растворе. К полученному концентрату добавили экстракт тел включения TEV в соотношении фермент-ГБ 1:100, а также добавили 1М раствор дитиотриэтола до концентрации последнего в реакционной среде 1 мМ. Инкубировали в течение 15 часов при температуре 37^оС и слабом перемешивании. Гидролиз гибридного белка прошёл, практически, полностью (Рис. 27).

Рис. 27. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Кинетика протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка в растворе. Где A – димер hVEGF₁₆₅, B – мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, C – мономер hVEGF₁₆₅.

Далее смесь, содержащую продукты ферментативного гидролиза, фракционировали, с помощью аффинной хроматографии на сорбенте гепарин сефароза по ранее описанной методики. Фракции содержащие целевой белок очищали с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С18 (Рис. 28).

Рис. 28 Профиль ВЭЖХ хроматографии на колонке Диасорб С18 фракций, содержащих hVEGF₁₆₅

.

hVEGF165 чистотой 98% элюировался с колонки начиная 18,6 мин по 19,1 минуту. Полученный элюат, содержащие чистый rhVEGF₁₆₅ был лиофилизирован. Итоговый выход целевого белка составил 22,4 мг с литра культуры.

Таблица 3. Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы E. coli Origami/pCBD-VEGF_165.

Этапы очистки	Общий белок (мг)	Содержание ГБ (%)	Содержание hVEGF165 (%)
Осветлённый клеточный лизат	428	15
Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose	77,2	90
Концентрирование на мембране YM 30	56	90
Расщепление ГБ TEV протеазой	56		76
Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose	34		90
ОФ ВЭЖХ	22,4		97