Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

Биологический факультет

Кафедра Биоорганической химии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук

(ИБХ РАН)

Учебно-Научный Центр

Дипломная работа

Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165.

Development of methods for isolation of the recombinant vascular endothelial growth factor VEGF 165

Выполнил: студент 5 курса Ханнанов Ринат Асхатович

Khannanov Rinat Askhatovich

Научный руководитель: с.н.с. лаб. Биотехнологии к.х.н. Есипов Р.С.

Москва 2012

Оглавление

Список сокращений……………………………………………………..…….3

Введение……………………………………………………………………...…5

Литературный обзор……..…………………………………………….……...7

Общие сведения о Васкулярных эндотелиальных факторах роста.......….…7

История открытия……………………………………………...……………............7

Семейство васкулярных эндотелиальных факторов роста………..........….10

Сосудистый эндотелиальный фактор роста –А…………………..……...........8

Васкулярный эндотелиальный фактор роста 165 (VEGF165)……..……….10

Биологическая роль VEGF 165…….……………….…………………..………….11

Применение васкулярного эндотелиального фактора роста VEGF 165 в медицине.…………………………………………………….……..………….……….16

Терапевтический ангиогенез….………………………………………...…………..16

Анти VEGF терапия..………………………………………………………..….......17

Методы получения рекомбинатногоVEGF 165 человеческого…………….21

Получение rhVEGF165 в эукариотической системе экспрессии….…………21

Получение rhVEGF165 в прокариотической системе экспрессии………..…22

Материалы…..……………………………………………………………......25

Методы…….……………………………………………………..…………....28

Результаты и обсуждение…………………………………………………...37

Заключение…………………………………………………………..………..54

Выводы…...…………………………………………………………………....55

Благодарности ……………………………………………………………….56

Список литературы………………………………………………………….57

Список сокращений

VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста

(Vascular endothelial growth factor)

VEGFR-1 – мембранный рецептор 1 сосудистого эндотелиального

фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

VEGFR-2 – мембранный рецептор 2 сосудистого эндотелиального

фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

CBD – хитинсвязывающий домен

FGF-1, -2 – фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)

FGFR – рецептор фактора роста фибробластов

PDGF – тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor)

PDGFR – рецептор тробмоцитарного фактора роста

HIF-1 – фактор, индуцируемый при гипоксии (hypoxic inducible factor)

Ang-1,-2 - ангиопоэтины

PAS - семейство доменов (PER-ARNT-SIM)

Per – белок кодируемый геном Drosophila melanogaster, отвечающий за

биоритмы организма (period circadian protein)

Arnt – аryl hidrocarbon receptor nuclear translocator protein

SIM – single minded protein

bHLH - семейство факторов транскрипции («спираль-петля-спираль»)

(basic Helix-Loop-Helix)

pVHL - опухолевый супрессор (von Hippel Lindau)

Tie-2 - мембранный киназный рецептор (Tunica interna endothelial

kinase-2)

MAPK - митоген-активированная киназа (mitogen-activated

protein kinase)

PI3K- фосфатидилинозитол 3-киназа (phosphatidylinositol 3-kinase)

Grb2 - белок сателлит фактора роста (Growth factor receptor-bound

protein 2)

FRS-2 – субстрат рецептора фактора роста фибробластов (Fibroblast growth factor receptor substrate 2)

Ras – сигнальный белок, принадлежащий семейству малых

гуанозинтрифосфатаз

Raf - сигнальный белок, серин/треонин-специфичная протеин-киназа

ERK – внутриклеточная сигнальная киназа (extracellular-regulated kinase)

MEK - митоген-активированная киназа киназа (Mitogen-activated protein

kinase kinase)

Src – семейство протоонкогенных тирозин киназ

C-Kit – поверхностный цитокиновый рецептор

ECM – межклеточный матрикс (extracellular matrix)

ATP - аденозин-5`-трифосфат

БСА – бычий сывороточный альбумин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПТГ – изопропилтио--D-галактозид

ПААГ – полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис - трис(гидроксиметил)метиламин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT – 1,4-дитиотреитол

dNTP – дезоксирибонуклеозид-5`-трифосфаты

SDS - додецилсульфат натрия

TEMED – N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин

Amp – ампициллин

Введение

Неоангиогенез — сложный многоступенчатый процесс, на каждом этапе которого задействованы различные регуляторные пути. К факторам, способствующим росту сосудов относятся ростовые факторы: кислый и основной факторы роста фибробластов (aFGF и bFGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), белки клеточной адгезии, белки матрикса, матриксные металлопротеиназы (MMP). Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и фактор роста фибробластов (FGF) (Парфенова и Ткачук, 2000). VEGF₁₆₅ был первой идентифицированной изоформой семейства васкулярных эндотелиальных факторов роста. VEGF₁₆₅ является основным сосудистым эндотелиальным фактором роста в человеческих тканях, поэтому нашел свое применение в качестве мощного проангиогенного препарата при моделировании процесса неоангиогенеза. Получение природного VEGF очень дорогостоящая процедура, и поэтому представляет большой интерес получение VEGF генно-инженерными методами. Применение в медицине препаратов, полученных гено-инженерным способом растёт, так как получение биологически активных белков из природных источников является, как правило, очень сложным и, как сказано выше, дорогостоящим процессом. Так рекомбинантный интерферон существенно выигрывает в сравнении с лейкоцитарным, вследствие низкой себестоимости и отсутствии контаминации конечного продукта вирусами человека (Cantell, 1998). Поэтому экспрессия чужеродных генов биотехнологическим способом представляет собой уникальную возможность для продукции важных фармацевтических препаратов.

Целью дипломной работы являлось получение рекомбинантного васкулярного эндотелиального фактора роста 165 человека, создание штамма продуцента, разработка методики выделения и очистки. Для решения поставленной цели были определенны следующие задачи:

1. Получить высокоэффективный штамм-продуцент E.coli, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

2. Подобрать условия культивирования штамма-продуцента сосудистого эндотелиального фактора роста .

3. Разработать схему выделения и очистки рекомбинатного сосудистого эндотелиального фактора роста.