2.5. Методы амплификации нуклеиновых кислот

Принцип метода

Методы ДНК диагностики основаны на комплементарном взаимодей­ствии нуклеиновых кислот, которое позволяет с высокой точностью иден­тифицировать последовательность нуклеотидов в генах искомого микро­организма. Из многочисленных модификаций данного метода следует выделить полимеразную цепную реакцию (ПЦР), как получившую наи­большее распространение. Метод ПЦР основан на том, что в исследуе­мый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекцион­ный агент, вносятся синтезированные в лаборатории нуклеотидные по­следовательности (праймеры), комплементарные генетическому мате­риалу искомого возбудителя. Такие праймеры способны специфически взаимодействовать с ДНК или РНК инфекционного агента. Если иссле­дуемую пробу подвергнуть температурной обработке, то двуспиральная ДНК, содержащаяся в инфекционном агенте, денатурирует и становится доступной для взаимодействия с двумя праймерами, комплементарны­ми определенной зоне ДНК или РНК исследуемого объекта. При повтор­ных циклах денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот образца в определенных условиях (содержание в реакционной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и термофильной ДНК полимеразы) достигается из­бирательное размножение (амплификация) участка нуклеиновой кисло­ты определенного размера, который задается при выборе праймеров. Этот метод широко используется для прямой детекции различного гене­тического материала вирусной и бактериальной природы.

Лигазная цепная реакция - это второй метод амплификации ДНК. В основе метода лежит лигирование (сшивание) олигонуклеотидов, ком­плементарных определенным участкам ДНК мишени. В методе исполь­зуется способность ДНК - лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с геномной ДНК мишени in vitro. По своим характеристикам этот метод сравним с ПЦР.

Материально-техническое обеспечение метода

Оборудование стандартной лаборатории для проведения ПЦР. Тест система для проведения ПЦР (набор праймеров). Одна из основных причин возникновения артефактов при использо­вании ПЦР-диагностики кроется в том, что фирмы, производящие набо­ры реагентов или лаборатории, использующие их в повседневной рабо­те, ориентируются на различные критерии оценки чувствительности и специфичности диагностических наборов. Возникающие разночтения не позволяют сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях, компрометируют сам метод и, в конечном счете, отражаются на досто­верности клинического диагноза. Поэтому требования к качеству тест-систем должны быть очень строги, следует подчеркнуть недопустимость использования не сертифицированных тест-систем. В нашей практике используются праймеры Полимик (Литех).

Методика

ПЦР состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции нуклеи­новой кислоты, собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК или РНК).

Методика постановки реакции изложена в соответствующих методи­ческих рекомендациях.

Подготовка пробы материала должна производиться в условиях, ис­ключающих ложноположительные результаты из-за перекрестного за­грязнения исследуемых проб. Для исключения ложноотрицательных ре­зультатов необходимо выделение ДНК либо РНК, что позволяет осуще­ствлять концентрированно исследуемой матрицы нуклеиновой кислоты в малом объеме. При необходимости следует провести удаление инги­биторов Taq-ДНК-полимеразы, что в ряде случаев отмечено при иссле­довании цервикальных образцов.

Следует отметить необходимость использования стандартных поло­жительных и отрицательных контролей при каждой постановке.

Показания и противопоказания к применению метода

При диагностике хламидиоза методами амплификации нуклеиновых кислот подходит материал любого тканевого генеза. Большим преиму­ществом методов амплификации нуклеиновых кислот является возмож­ность диагностики "неинвазивным" способом - исследование первой пор­ции утренней мочи, что может применяться для скрининга больших групп населения. Следует отметить, что исследование утренней мочи более чувствительно при обследовании мужчин, для женщин предпочтение от­дается исследованию цервикальных образцов.

Определение нуклеиновых кислот хламидий не должно применяться при контроле излеченности, так как фрагменты нуклеиновых кислот не­жизнеспособных бактерий могут определяться в течение нескольких ме­сяцев после проведенного лечения. Как упоминалось выше, при контро­ле излеченности следует применять метод культуральной диагностики.

Достоинством ПЦР является возможность определения широкого спек­тра возбудителей в одном клиническом образце. Для этого полученный препарат распределяется на равные порции, число которых равно числу определяемых инфекционных агентов. В каждую из порций вносится ре­акционная смесь и специфический набор праймеров для каждой из иско­мых инфекций. Таким образом, можно получить "микробиологический паспорт", т.е. полные сведения о наличии всех возбудителей в исследуемой клинической пробе.

Следует подчеркнуть, что ДНК-матрицы генов в условиях инактивации ДНК-азы пригодны для ПЦР в течение длительного времени (десят­ки, сотни и даже тысячи лет).

Чувствительность ПЦР и ЛЦР может достигать математически воз­можного предела (детекция 1 копии ДНК-матрицы).

В то же время следует иметь в виду, что само по себе использование метода молекулярно-биологической диагностики не является гарантией от получения ошибочных результатов. Высокая чувствительность мето­да обуславливает необходимость строгого соблюдения специальных тре­бований к режиму работы ПЦР-генодиагностической лаборатории.