14. Растворимость, коллоидные свойства, денатурация и оптические свойства белков.

Белки - природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в полипептидные цепи. В процессах жизнедеятельности всех организмов белки выполняют структурную, регуляторную, каталитическую, защитную, транспортную, энергетическую и другие функции. Белки - основа кожи, шерсти, шелка и других натуральных материалов, важнейшие компоненты пищи человека и корма животных. Названию белки, наиболее принятому в отечественной литературе, соответствует термин протеины (от греч. proteios — первый).

Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать вьшадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

Свойства белковых растворов определяются большими размерами молекул, т.е. белки являются коллоидными частицами и образуют коллоидные растворы.

К свойствам белковых растворов относятся:1. Рассеивание света вследствие дифракции на коллоидных частицах – опалесценция. Особенно это заметно при прохождении луча света через белковый раствор, когда виден светящийся конус (эффект Тиндаля).2. Белковые растворы в отличие от истинных обладают малой скоростью диффузии.3. Неспособность белковых частиц проникать через мембраны, поры которых меньше диаметра белков (полунепроницаемые мембраны). Это используется в диализе. Очистка белковых препаратов от посторонних примесей лежит в основе работы "искусственной почки" при лечении острой почечной недостаточности.4. Создание онкотического давления, то есть перемещение воды в сторону более высокой концентрации белка, что проявляется, например, как формирование отеков при повышении проницаемости сосудистой стенки.5. Высокая вязкость в результате сил сцепления между крупными молекулами, что проявляется, например, при образовании гелей и студней

Денатурация белков (от лат. de- — приставка, означающая отделение, удаление и лат. nature — природа; не путать с лат. denaturatus — лишенный природных свойств) — термин биологической химии, означающий потерю белками их естественных свойств (растворимости, гидрофильности и др.) вследствие нарушения пространственной структуры их молекул.Процесс денатурации отдельной белковой молекулы, приводящий к распаду её «жёсткой» трёхмерной структуры, иногда называют плавлением молекулы. Механизмы денатурацииПрактически любое заметное изменение внешних условий, например, нагревание или обработка белка кислотой приводит к последовательному нарушению четвертичной, третичной и вторичной структур белка. Обычно денатурация вызывается повышением температуры, действием сильных кислот и щелочей, солей тяжелых металлов, некоторых растворителей (спирт), радиации и др.Денатурация часто приводит к тому, что в коллоидном растворе белковых молекул происходит процесс агрегации частиц белка в более крупные. Визуально это выглядит, например, как образование «белка» при жарке яиц.

РенатурацияРенатурация (высаливание) — процесс, обратный денатурации, при котором белки возвращают свою природную структуру. Нужно отметить, что не все белки способны ренатурировать; у большинства белков денатурация необратима.

ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ?????

15. Методы выделения и очистки белков.Препараты высокоочищенных белков находят разнообразное применение в научных исследованиях, медицине и биотехнологии. Так как многие белки, и в особенности глобулярные, высоколабильны (см. с. 80), выделение проводят с помощью предельно мягких методов и при пониженной температуре (0-5°С). К таким методам относится ионообменная хроматография, которая обсуждалась на с. 68. Другие методы выделения белков представлены в этом разделе.A. ВысаливаниеРастворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов (светло-синие кружочки) связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН₄)₂SО₄, разделить (фракционировать) смесь белков.Б. ДиализДля отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.B. Гель-фильтрацияГель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков (1б) вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля (1в). На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций (2). Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы (3).Г. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрияВ настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля (см. с. 270). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C₁₂H₂₅OSO₃Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами (см. с. 34). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики (1).Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида (2). После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков (а); выделенного из экстракта гомогенного белка (б); контрольной смеси белков с известными молекулярными массами (в).

16. Некоторые природные пептиды и белки (окситоцин, вазопрессин, адренокортикотропный гормон, инсулин, гастрин, глюкагон, глютатион и др.), их биологические функции.

ОКСИТОЦИН, пептидный гормон млекопитающих; кристаллич. в-во; хорошо раств. в воде; рI 7,7. Окситоцин образуется в передних ядрах гипоталамуса, хранится в заднем гипофизе (нейрогипофизе), куда транспортируется с помощью спец. белка-переносчика нейрофизина. Выделение окситоцина стимулируют растяжение матки на поздних сроках беременности, а также раздражение соска при. Биол. эффект осуществляется посредством взаимод. молекул окситоцина с рецепторами цитоплазматич. мембран органов-мишеней и активации в них фермента аденилатциклазы,

ВАЗОПРЕССИН (от лат. vas - сосуд и presso - давлю) пептидный гормон гипофиза. Первичная структура вазопрессина у большинства млекопитающих, в т.ч. у человека. Вазопрессин близок по хим. строению окситоцину. У низших позвоночных (птицы, амфибии и рыбы) в гипофизе обнаружен прир. аналог вазопрессина – вазотоцин к-рый обладает биол. активностью как вазопрессина, так и окситоцина. Вазопрессин усиливает реабсорбцию воды в почечных канальцах, уменьшая мочеотделение и повышая осмотич. концентрацию мочи (антидиуретич. действие).Недостаточность вазопрессина в организме обусловливает развитие несахарного диабета (поэтому вазопрессин применяется для его лечения). Препараты вазопрессина выделяют из гипофиза животных либо синтезируют.

АДРЕНОКОРТИКОТРОПИН (кортикотропин, адренокоргикотропный гормон, АКТГ), пептидный гормон гипофиза. Осн. физиол. ф-ция адренокортикотропина - стимуляция биосинтеза и секреции стероидных гормонов корой надпочечников. Адренокортикотропин обладает также меланоцитостимулирующей активностью, к-рая обусловлена присутствием в его молекуле 13 аминокислотных остатков N-концевого участка, повторяющих последовательность аминокислот вмеланоцитостимулирующем гормоне. Кроме того, адренокортикотропин активирует липазу жировой ткани и повышает выход своб. жирных к-т из жировых депо в кровь. Адренокортикотропин вырабатывается специализиров. клетками передней доли гипофиза.

ИНСУЛИН, белковый гормон, вырабатываемый поджелудочной железой и регулирующий уровень сахара (глюкозы) в крови; препараты инсулина применяются для лечения сахарного диабета. Слово «инсулин» (от лат. insula – остров) указывает на «островковое» происхождение гормона.Молекула инсулина состоит из двух аминокислотных цепей; А-цепь содержит 21 аминокислоту, В-цепь – 30.Соединенные цепи частично изгибаются и сворачиваются в глобулярную структуру, и такая конфигурация молекулы гормона важна для проявления его биологической активности.Инсулин – важнейший регулятор промежуточного обмена веществ. Главное его действие заключается в снижении уровня сахара в крови: он облегчает поглощение и использование глюкозы мышечными и жировыми клетками и тормозит образование новых молекул глюкозы в печени. Кроме того, он способствует запасанию глюкозы в клетках в форме гликогена, а также накоплению других веществ – потенциальных источников энергии (жира, белка), тормозят их распад и утилизацию организмом.

ГАСТРИН (от греч. gaster - желудок), пептидный гормон желудочно-кишечного тракта. Основная физиол. ф-ция гастрина-стимуляция секреции к-ты в желудке. Гастрин вырабатывается специализиров. клетками, рассеянными по слизистой оболочке почти всего пищеварит. тракта. В наиб. кол-ве эти клетки локализуются в антральном отделе желудка и в двенадцатиперстной кишке. Освобождение гастрина происходит под влиянием парасимпатич. нервной системы и разл. компонентов пищи.

ГЛЮКАГОН, пептидный гормон поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Осн. ф-ция глюкагона-стимуляция расщепления гликогена в печени, в результате чего происходит повышение концентрации глюкозы в крови. Глюкагон стимулирует также липолиз жировой ткани и выработку инсулина поджелудочной железой и сокращение сердечной мышцы. По своему действию глюкагон-антагонист инсулина. Вырабатывается глюкагон специализиров. клетками поджелудочной железы (т. наз.клетками островков Лангерганса) и слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Препараты глюкагона (их получают из поджелудочной железы животных или синтезируют) находят применение при определении гликогена в печени и для компенсации отдельных форм гипогликемии.

ГЛУТАТИОН (Lглутамил-L-цистеинилглицин), бесцв. кристаллы; т. пл. 190°С (с разл.); раств. в воде, не раств. в этаноле и эфире. Специфич. метод определения глутатиона основан на его способности активировать превращ. метилглиоксаля в молочную к-ту под действием фермента глиоксалазы. Глутатион найден у животных, растений, микроорганизмов Биол. ф-ции глутатиона: защищает SH-группы ферментов и др. белков от окисления; восстанавливает Н2О2 и др. пероксиды; связывает своб. радикалы; участвует в тиол-дисульфидном обмене и в обезвреживании мн. чужеродных для организма соед. (см. Глутатионтрансферазы); восстанавливает рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды; переносит аминокислоты через мембрану клеток (см.Г лутамилтрансфераза); является кофактором ряда ферментов, напр. глиоксалазы и формальдегиддегидрогеназы.