31.Генна інженерія.

Рекомбінації генів, що були розглянуті вище, є природним процесом, який реалізується in vivo і є біологічним механізмом, спрямованим на збільшення різноманітності генетичного матеріалу в клітинах різних організмів. Генна інженерія, або технологія рекомбінантних ДНК — науково-практичний напрямок сучасної біомедичної науки, основою методології якого є виділення з клітин індивідуальної ДНК та спрямоване маніпулювання з її молекулами, зокрема отримання молекулярних химер, тобто молекул, сформованих із фрагментів ДНК різних біологічних видів

Технологія трансплантації генів:

1) отримання в чистому вигляді, тобто у формі ізольованого фрагмента ДНК, гена з певними властивостями (тобто такого, що кодує синтез необхідного ферменту, гормону тощо); 2) конструювання рекомбінантної (гібридної, химерної) молекули ДНК; 3) введення рекомбінантної ДНК всередину реципієнтної бактеріальної клітини

(тобто такої, в якій буде здійснюватися реплікація, клонування необхідного гена); 4) клонування рекобінантної ДНК.

1. Отримання необхідного гена.

Отримання гена (молекули ДНК), що буде підлягати реплікації (клонуванню) з виходом значної кількості реплік, може бути здійснено такими методами: – хімічним синтезом гена (можливо тільки для коротких генів, що складаються з декількох десятків азотистих основ); – виділенням необхідного гена (фрагмента ДНК) з цілісного геному клітини– конструюванням на мРНК (що кодує синтез білка, який бажано отримати в результаті біотехнологічної процедури) комплементарної відносно неї ДНК (кДНК). Цей метод потребує застосування зворотної транскриптази — ферменту, що присутній в деяких РНК-вмісних вірусах і забезпечує синтез ДНК на РНК матриці згідно з рівнянням реакції:

2. Конструювання рекомбінантної ДНК.

Ген, що був отриманий за допомогою вищерозглянутої процедури (кДНК), необхідно ввести в бактеріальну клітину таким чином, щоб він інтегрувався в її геном. Для цього формують рекомбінантну ДНК, що складається з кДНК та особливої молекули ДНК, яка править за провідник, або вектор, здатний до проникнення в реципієнтну клітину. Біологічно важливими і практично корисними для генної інженерії властивостями плазмід є їх здатність до переходу з однієї клітини в іншу за механізмом трансформації або кон’югації, а також спроможність включатися в бактеріальну хромосому та реплікуватися разом з нею. Для конструювання рекомбінантної ДНК як кільцеву ДНК плазміди, так і лінійну кДНК розщеплюють за допомогою високоспецифічних до певних нуклеотидних послідовностей ендонуклеаз — так званих рестриктаз. У ролі векторів для кДНК застосовують віруси або плазміди. Розщеплення ДНК плазміди та кДНК (гена) специфічними рестриктазами призводить до утворення розрізаних в

певних сайтах молекул ДНК з “липкими” кінцями. При взаємодії in vitro “розрізаних” плазміди та гена їх полінуклеотидні ланцюги, що складають “липкі” кінці, взаємодіють із утворенням водневих зв’язків між комплементарними основами, як це зображено вище. Застосування ДНК-лігази, яка утворює 3'-5'-фосфодіефірні зв’язки між кінцевими нуклеотидами, призводить до “зшивання” плазміди та гена і завершує утворення рекомбінантної ДНК3. Введення рекомбінантної ДНК всередину реципієнтної клітини та клонування необхідного гена.

Рекомбінантні ДНК, що складаються з плазмідної ДНК та ДНК гена, що трансплантується при взаємодії з бактеріальними клітинами, можуть проникати всередину останніх. Усередині клітини хазяїна відбувається реплікація (клонування) рекомбінантної ДНК з утворенням багатьох тисяч копій. У подальшому ці клоновані ДНК виходять з бактеріальної клітини, і з них можливо (знову ж таки за допомогою рестриктаз) виділити велику кількість копій шуканого гена. За технологією, що розглянута,

здійснено генно-інженерний синтез інтерферону людини, людських інсуліну, гормону росту, соматостатину, активатора плазміногену, білкових препаратів для діагностики СНІДу тощо.