19 Біологічне значення реплікацїї днк. Напівконсервативний механізм реплікації

Напівконсервативний та консервативний механізми реплікації

Модель подвоєння (реплікації) молекули ДНК, що була первинно запропонована

Дж.Уотсоном та Ф.Кріком, отримала назву напівконсервативного механізму реплікації.

Згідно з цим механізмом, “материнська” молекула ДНК в процесі реплікації

розділяється на два ланцюги, кожен з яких править за матрицю для синтезу за

принципом комплементарності другого ланцюга з утворенням ідентичних “дочірніх”

молекул. Поряд із зазначеною моделлю Уотсона-Кріка, як теоретично можливий розглядався також консервативний механізм реплікації, відповідно до якого при подвоєнні клітини “стара” материнська молекула ДНК залишається незайманою, а з вільних мононуклеотидів складаються повністю нові молекули ДНК:

Експериментальн обгрунтування напівконсервативного меха-

нізму реплікації Головна ідея експерименту грунтувалася на різній питомій щільності і, відповідно, можливості фракціонування методом ультрацентрифугування в

градієнті щільності CsCl молекул ДНК, що відрізняються за вмістом легкого (N14) або важкого (N15) ізотопів азоту. Схему експерименту можна розділити на

такі етапи: 1) вирощування клітин E.Coli на середовищі, що містило як джерело азоту

NH4Cl з легким ізотопом (N14); була встановлена щільність “легких” молекул ДНК,

що містилися в таких клітинах ;2) вирощування клітин E.Coli протягом декількох поколінь на середовищі, що містило як джерело азоту NH4Cl з важким ізотопом (N15); була встановлена щільність “важких” молекул ДНК, що містилися в таких клітинах ;

3) клітини E.Coli, що містили у своєму складі “повністю важкі” молекули ДНК (N15-ДНК) знову були перенесені на середовище з легким (N14) ізотопом азоту; після першої реплікації дочірні клітини (F1) збиралися, з них екстрагувалася ДНК і методом ультрацентрифугування визначалася її щільність. Було встановлено, що щільність цієї ДНК з покоління F1 була проміжною між щільністю “легких” (N14) та “важких” (N15) молекул ДНК, тобто складалася наполовину з “легких” і наполовину з “важких” ланцюгів, що відповідало будові (N14, N15-ДНК) , підтверджуючи тим самим напівконсервативний механізм реплікації.

20 Послідовність етапів ферменти реплікації днк у прокаріотів та

ЕУКАРІОТІВ Дослідження А.Корнберга (відкриття ДНК-полімерази I)

Загальна схема біосинтезу ДНК у системі А.Корнберга

А.Корнберг та співавт. (Kornberg Artur, 1956) інкубували екстракти E.Coli, що

містили ферменти та деяку кількість ДНК, із сумішшю дезоксинуклеозидтрифос-

фатів (дНТФ), а саме: дАТФ, дТТФ, дГТФ та дЦТФ. Було встановлено, що в цих умовах синтезується певна кількість нової ДНК (точніше, полідезоксирибонуклеотиду), до складу якого входили дезоксинуклеозидмонофосфати (дНМФ) із складу дНТФ, що були використані для біосинтезу. При цьому новий ланцюг ДНК утворювався за рахунок приєднання дНМФ до кінця одного з ланцюгів ДНК, що вже існувала (передіснуючої ДНК).

Фермент, що каталізував зазначену реакцію, отримав назву ДНК-полімерази I, і його

вивчення дозволило з’ясувати деякі принципові особливості біосинтезу ДНК як у

прокаріотів, так і в еукаріотів, хоча, як з’ясувалося, він не є основним ензимом в

реплікації ДНК, а виконує в цьому процесі певні допоміжні функції. Необхідність вихідної (передіснуючої) ДНК в системі Корнберга ДНК-полімераза I, що здійснювала утворення 3'-5'-фосфодіефірних зв’язків в системі Корнберга, могла функціонувати тільки в присутності вже існуючої (“передіснуючої”) ДНК. Передіснуюча ДНК, що необхідна для утворення нового полідезоксирибонуклеотиду, виконує дві функції (рис. 20.6). Вона служить: (1) затравкою для подовження ланцюга полідезоксирибонуклеотиду; (2) матрицею, що визначає (програмує) послідовність включення в ланцюг, що синтезується, нових нуклеотидів. Пізніше було встановлено,

що ДНК-полімераза I (“фермент Корнберга”) не є основним ферментом в реплікації

ДНК у прокаріотів. Проте, певні особливості цього синтезу виявилися справедливими і для функціонування інших полімераз. Особливості синтезу ДНК в ДНК-полімеразній системі: – ДНК-полімераза не може синтезувати повністю новий ланцюг ДНК, а спроможна лише приєднувати дНМФ до вже існуючого ланцюга; – синтез нового ланцюга ДНК відбувається в напрямку 5'-3', тобто ДНК- полімераза послідовно приєднує нуклеотиди (дНМФ з наявних дНТФ) до 3'-кінця одного з ланцюгів ДНК (ланцюга-”затравки”); – для синтезу нового ланцюга ДНК необхідний також ланцюг-матриця; нуклеотиди сполучаються з 3'-кінцем ланцюга-”затравки” відповідно до нуклеотидної послідовності в ланцюгу-”матриці” (тобто, за принципом комплементарності). Механізм подовження (елонгації) ланцюга ДНК полягає в утворенні нових 3'- 5'-фосфодіефірних зв’язків, що синтезуються в напрямку 5'→3'. При цьому відбувається нуклеофільна атака з боку вільної 3'-гідроксильної групи кінцевого

нуклеотиду ланцюга, що вже існує, на -фосфат дНТФ, який вступає в реакцію: Ферменти біосинтезу ДНК у прокаріотів 1) ДНК-полімераза I — білок з м.м. 103 кД.

Біохімічні функції: 5'→3' — полімеразна активність (розглянута вище);

5'→3' — екзонуклеазна активність (тобто спроможність видаляти нуклеотиди

вище від напрямку синтезу); 3'→5' — екзонуклеазна активність (“коригуюча” активність, або спроможність видаляти вже включений нуклеотид, якщо він включений помилково, тобто не є комплементарним ланцюга-матриці); 2) ДНК-полімераза II (білок з м.м. 120 кД) не є основним в реплікації ДНК у прокаріотів; за уявленнями, що існують, переважною функцією цього ферменту є участь у репарації ДНК;

3) ДНК-полімераза III — головний фермент, що реалізує процес елонгації ДНК у

E.Coli. За своєю молекулярною будовою ДНК-полімераза III є асиметричним димером з

м.м. близько 900 кД. Це мультисубодиничний фермент, ціла молекула якого

(холофермент) містить у своєму складі 10 типів субодиниць — поліпептидних

ланцюгів. Фермент має 5'→3' -полімеразну, 3'→5' -екзонуклеазну та АТФ-азну активності. ДНК-полімераза III є високопроцесійним ферментом, що може, не залишаючи матрицю, каталізувати сполучення в ланцюг багатьох тисяч мононуклеотидів (на відміну від 15-20 нуклеотидів при дії ДНК-полімерази I). Швидкість полімеразної реакції складає близько 1000 нуклеотидів за секунду.

АТФ-азна активність є передумовою утворення комплексу холоферменту ДНК-

полімерази з матрицею: спочатку АТФ взаємодіє з -субодиницею холоферменту, а

потім активований холофермент сполучається з матричним ланцюгом ДНК, що

супроводжується гідролізом АТФ.