Тема 32 лабораторная диагностика бруцеллеза, туляремии.

БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятий. Ознакомить студентов со свойствами возбуди­телей и лабораторной диагностикой бруцеллеза и туляремии, а также биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Единый бруцеллезный антиген, антиген для кольцевой реакции с молоком, роз-бенгал антиген, позитивная бруцеллезная сыворотка, негативная сыворотка, фи­зиологический раствор, содержащий 0,5 % фенола, серологичес­кие пробирки, штативы, мерные пипетки, красители для окраски по Граму, Козловскому (Стампу), пробы молока.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Бруцеллез. Это хроническая инфекционная болезнь, проявляю­щаяся абортами, задержанием последа, эндометритами и рас­стройством воспроизводительной функции животных. Восприимчивы многие виды сельскохозяйственных животных и человек.

Возбудитель — бактерии рода Brucella: В. melitensis (три биова­ра) — основной хозяин овцы и козы; В. abortus (девять биоваров) — основной хозяин крупный рогатый скот; В. suis (четыре биовара) — основной хозяин свиньи, а также северные олени и зайцы; В. ovis— основной хозяин овцы; В. neotomae — основной хозяин древесные крысы; В. canis — основной хозяин собаки.

Лабораторная диагностика бруцеллеза основана на результатах бактериологических и серологических исследований.

Бактериологическое исследование в ос­новном применяют при первичной постановке диагноза на бру­целлез в ранее благополучных хозяйствах.

Материал для исследования. В лабораторию направляют пробы крови (сыворотки) для серологических исследований, абортиро­ванный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей или желудок плода, кусочки печени, селезенки, пробы молока (последние порции). При убое живот­ных берут паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пора­женные суставы, у самцов — семенники. Объектом исследования могут быть молочные продукты (брынза, сыр, масло и др.), объекты внешней среды.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки из материала окрашивают по Граму и одним из специальных мето­дов (по Козловскому, Стампу и др.). Бруцеллы — грамотрицательные короткие палочковидные или кокковидные бактерии размером 0,5... 1,5 мкм, без жгутиков, спор не образуют, форми­руют микрокапсулу. В окрашенном препарате располагаются одиночно, реже парами, короткими цепочками.

Окраска по методу Козловского: препарат окрашивают 2%-м водным раствором сафранина 2 мин, промывают водой, докра­шивают 1%-м водным раствором малахитовой зелени 1 мин, про­мывают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы красные, остальные бактерии зеленые.

Окраска по методу Стампа: фиксированный на пламени мазок окрашивают фуксином Пфейффера 10 мин, промывают водой, обрабатывают 0,5%-м водным раствором уксусной кислоты 30 с, затем препарат промывают водой и докрашивают 1%-м водным раствором метиленового синего 20...30 с. Микроскопическая кар­тина: бруцеллы красные, другие бактерии синие.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Бруцеллы — аэробы, микроаэрофилы, температурный оптимум 37...38 °С, рН 6,8...7,2. Материал засевают на специальные питательные среды: мясо-пептонный агар и бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый агар и бульон, картофельный агар, эритрит-агар, сывороточ-но-декстрозный агар и др. Печеночные среды включают в себя отвар печени. Картофельный агар готовят на отваре картофеля, глюкозу и глицерин добавляют в среды соответственно в количе­стве 1 % и 2...3 %. Эритрит-агар содержит вещество (эритрит), стимулирующее рост бруцелл. В состав сывороточно-декстрозно-го агара помимо обычной питательной основы входит 10 % сыво­ротки крови и 1 % декстрозы.

Некоторые виды бруцелл растут при повышенном содержа­нии в атмосфере оксида углерода (IV) (В. abortus, В. ovis). Так как неизвестно, каким видом бруцелл заражен исследуемый матери­ал, половину посевов инкубируют в обычной атмосфере, дру­гую — в атмосфере, содержащей 10...15% оксида углерода (IV).

Посевы культивируют в течение ЗО сут, периодически просмат­ривая. Рост бруцелл чаще появляется на 7... 10-е сутки, иногда позже.

На плотных средах возбудитель формирует мелкие, прозрач­ные, круглые, с ровными краями, гладкой поверхностью, с голу­боватым оттенком колонии (S-форма), возможно появление шероховатых колоний (R-форма) (рис. 99, 100). По мере старения колонии мутнеют и за счет пигментообразования могут темнеть. На жидких питательных средах рост бруцелл проявляется равно­мерным помутнением среды, образованием голубоватого присте­ночного кольца, позднее формируется небольшой осадок.

У выросших культур изучают морфологию и тинкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по методам Грама, Коз­ловского.

Культуру идентифицируют серологически в РА на стекле с по­зитивной бруцеллезной сывороткой, разведенной в соотноше­нии 1:50. Виды В. melitensis, В. abortus, В. suis антигенно род­ственны, поэтому их клетки аг­глютинируют в стандартной бру­целлезной сыворотке. Для иден­тификации В. ovis кроликов им­мунизируют выделенной куль­турой и затем кроличью сыворотку исследуют в РДСК со стандартным овисным антиге­ном (В. ovis) — должна быть четкая положительная реакция, если это культура В. ovis.

Рис. 100. Бруцеллы в чистой культуре

Для определения видовой принадлежности у выделенных культур бруцелл изучают потребность в оксиде углерода (IV), об­разование сероводорода, способность к росту на питательных средах с тионином и фуксином, чувствительность к бруцеллез­ным бактериофагам, ферментацию аминокислот, углеводов, а также агглютинабильность с моноспецифическими сыворотками против отдельных клеточных антигенов бруцелл (А, М, R). Неко­торые из дифференцирующих характеристик приведены в табли­це 30.

Биопроба. Это эффективный метод обнаружения бруцелл в исследуемом материале, особенно загрязненном. Морских сви­нок перед заражением исследуют в РА, в опыт берут животных, в сыворотке которых не обнаружены антитела к возбудителю. Тканевый материал в виде суспензии (1 : 10) в объеме 1 мл вво­дят подкожно. О результате биопробы судят по данным иссле­дования сыворотки крови на 15, 25 и 40-й день после заражения (животные не погибают). Появление антител в титре 1 : 10 и бо­лее оценивают как положительный результат. Реагирующих жи­вотных убивают и подвергают бактериологическому исследова­нию.

Серологическая диагностика: при массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз-бенгал пробу (РА на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР).

Пробирочная РА. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разводят физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола; сыворотки крови овец коз, буйволов разводят 5%-м, а сыворотки оленей — 10%-м фенолизированным физиологичес­ким раствором. Сыворотки крови крупного рогатого скота, ло­шадей, верблюдов исследуют в разведениях от 1 : 50 до 1 :400; овец, коз, свиней, буйволов, оленей, собак — в разведениях 1 : 25 и более; пушных зверей — 1 : 10 и более. При массовых исследо­ваниях сыворотки крови исследуют в двух первых разведениях. После приготовления разведений сыворотки в объеме 0,5 мл в каждую пробу добавляют 0,5 мл разведенного до концентрации клеток 5*10⁸/мл единого бруцеллезного антигена (при этом раз­ведения удваиваются), компоненты перемешивают встряхивани­ем, штатив с пробирками помещают в термостат при 37...38 ºС на 18...20 ч, затем оставляют на несколько часов при комнатной температуре. Результат учитывают по общепринятой системе (см. тему 15). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки.

РА при бруцеллезе крупного рогатого скота, лошадей и верб­людов считают положительной, если титр составляет 1 : 100 и бо­лее (1 :50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буй­волов и собак — 1 : 50 (1 : 25 — сомнительный результат). При по­лучении сомнительных реакций сыворотки крови от этих живот­ных исследуют повторно через три-четыре неделим. В ходе массовых серологических исследований практикуют исследова­ние сывороток в двух первых разведениях. При этом необходимо учитывать, что некоторые сыворотки, не агглютинирующие ан­тиген в малых разведениях, в более высоких разведениях дают положительный результат — этот так называемый феномен «про-зоны», который может служить причиной ложных отрицатель­ных результатов.

В разных странах для пробирочной РА готовят антигены, раз­личающиеся по агглютинабильности, что делает несопоставимы­ми титры, полученные при исследованиях. Поэтому рекомендо­вано выражать результат пробирочной РА в международных еди­ницах (ME). Для этого предложена международная стандартная бруцеллезная сыворотка, по отношению к которой и определяют активность национальных антигенов. Активность этой сыворот­ки установлена в 1000 ME. Например, с каким-то национальным антигеном международная сыворотка в пробирочной РА показы­вает титр 1 : 500, значит, если с этим антигеном какая-либо дру­гая сыворотка дает титр РА 1 : 500, то она содержит 1000 МЕ, если вторая исследуемая сыворотка показывает титр 1 :400, то ее активность в международных единицах составит 1000 • 400/500 = 800 ME и т.д. В каждой стране разработана национальная бруцеллезная стандартная сыворотка, соответствующая по ак­тивности международной. По указанным критериям положи­тельные титры РА на бруцеллез для крупного рогатого скота составляют 100 ME (50 ME — сомнительный результат), для овец, коз, буйволов, оленей и собак — 50 ME (25 ME — сомни­тельный результат).

Роз-бенгал проба (РБП). В отличие от пробирочной РА данная серологическая реакция является качественной. С ее помощью в сжатые сроки исследуют большое количество животных. Сыво­ротки, давшие положительную РБП, дополнительно исследуют в пробирочной РА и РСК. Техника постановки РБП изложена в теме 15. В РБП исследуют неразведенную сыворотку крови, влия­ние нормальных антител на специфичность реакции нивелируется использованием антигена с кислыми значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностью не реагируют с антиге­ном, что обеспечивает достаточно высокую специфичность РБП.

РСК. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Предварительно инакти-вированные в течение 30 мин сыворотки крови (лошадей при 56...58 °С, крупного рогатого скота при 60...62 °С, свиней при 60...62°С, овец и коз при 58...60°С) исследуют в разведении 1:5...1:10. Положительным результатом РСК (РДСК) считают задержку гемолиза на два креста и более в разведении сыворотки крови 1:5.

Кольцевая реакция с молоком (КР). Метод применяют для ори­ентировочной проверки благополучных по бруцеллезу молочных стад и для контроля молока на рынке.

В бактериологическую пробирку наливают 2 мл исследуемого молока, добавляют 0,1мл антигена — клетки бруцелл, окрашен­ные гематоксилином. Пробирки встряхивают и помещают в во­дяную баню при 37...38 ºС на 45...50 мин, после чего учитывают результат. Положительный результат — верхняя часть столбика молока (сливки) синего цвета, остальное молоко белое или слег­ка синеватое. Отрицательный результат — слой сливок белый, молоко равномерно окрашено в синий цвет. Сомнительный ре­зультат — сливки слабо окрашены в синий цвет, молоко синего цвета.

Аллергическая диагностика не принадлежит к лабораторным методам; ее применяют непосредственно в хозяйствах. При бру­целлезе развивается состояние гиперчувствительности замедлен­ного типа (ГЗТ), которое может сопровождаться синтезом анти­тел, улавливаемых в серологических реакциях, но иногда ГЗТ от­мечают при отрицательных показаниях серологических тестов. Для обнаружения ГЗТ у животных используют диагностический аллерген — бруцеллин (см. тему 20).

Биопрепараты. Вакцина из штамма В. abortus № 19. Это наи­более изученная вакцина. Вакцинный штамм выращивают на плотных питательных средах. Устанавливают концентрацию микробных клеток 8 • 10¹⁰/мл, лиофильно высушивают. Готовый препарат контролируют на чистоту роста, диссоциацию, безвред­ность на морских свинках и белых мышах, одновременно у морс­ких свинок проверяют наличие серологического ответа на введе­ние вакцины. Иммуногенность препарата контролируют на мор­ских свинках.

Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютино-генного штамма № 82 отличается от вакцины из штамма № 19 слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологичес­ких реакций дифференцировать вакцинированных животных.

Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК полу­чают следующим образом: культуру вакцинного штамма № 19 выращивают на плотной питательной среде, бактериальную массу инактивируют, проверяют на чистоту и стерильность пу­тем микроскопии и высевом на питательные среды. Контроли­руют на специфичность с физиологическим раствором и нега­тивной сывороткой. Активность проверяют в РА и РСК с на­циональной стандартной бруцеллезной агглютинирующей сы­вороткой.

Антиген для кольцевой реакции с молоком. Микробную массу культуры В. abortus (штамм № 19) готовят, как для единого бру­целлезного антигена, инактивируют, устанавливают необходи­мую концентрацию микробных клеток, протравливают сульфа­том железа, окрашивают в синий цвет гематоксилином, контро­лируют на стерильность, специфичность и активность (см. тему 20).

Роз-бенгал антиген представляет собой суспензию бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розо­вый цвет. Антиген контролируют на стерильность, чистоту, рН. Специфичность проверяют с физиологическим раствором и не­гативными сыворотками, активность — методом титрования с национальной стандартной сывороткой.

Флуоресцирующую бруцеллезную сыворотку готовят из пози­тивной бруцеллезной сыворотки, глобулины которой метят флуоресцеинизотиоцианатом.

Позитивную бруцеллезную сыворотку получают гиперимму­низацией животных-продуцентов. Используют для контроля при постановке серологических реакций (РА, РСК и др.), а также серологической идентификации бруцелл.

Диагностический аллерген-бруцеллин представляет собой стерильную, прозрачную, желтоватого цвета жидкость, содержа­щую продукты жизнедеятельности бруцелл и вещества, извлеченные из них. Бактериальную массу выращивают (штамм В. abortus В-1) на агаровой среде, прогревают при 105... 110 °С 1ч, центрифугируют, надосадочную жидкость стерилизуют фильтро­ванием, бактериальную массу ресуспендируют в физиологическом растворе. Процедуру нагревания, центрифугирования и стерили­зации повторяют, после чего оба фильтрата объединяют. Полученный препарат контролируют, как описано ранее (см. тему 20).

Туляремия. Острая инфекционная болезнь. У сельскохозяй­ственных животных обычно протекает в септической форме. Ха­рактеризуется увеличением лимфатических узлов, симптомами поражения нервной системы, у крупного рогатого скота может проявляться маститами, у лошадей — абортами. Из сельскохо­зяйственных животных к возбудителю туляремии наиболее чув­ствительны поросята, ягнята, из диких животных — грызуны. Восприимчив человек.

Возбудитель туляремии — бактерия Francisella tularensis (при­надлежит к роду Francisella). Подразделяют на два биовара: F. tularensis sb. tularensis и F. tularensis sb. palaearctica. Для вида F. novicida характерна незначительная вирулентность.

Лабораторная диагностика туляремии основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры мето­дом биопробы и посевом на питательные среды; идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментатив­ным, серологическим свойствам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют мочу, фекалии, абортированный плод; для посмертной — печень, почки, селезенку, увеличенные лим­фатические узлы; трупы мелких животных, грызунов — целиком. При необходимости материал консервируют глицерином.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпе­чатки окрашивают по Граму и Романовскому—Гимзе. F. tularensis-— мелкая [(0,3...0,7) х (0,2...0,4) мкм] грамотрицательная палочковидная бактерия, преимущественно в форме кокко-бактерии. Красители воспринимает плохо, без жгутиков, спор не образует, но формирует капсулу (рис. 101). Из-за мелких размеров возбудителя его микроскопическое обнаружение затруднительно.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель туляремии — строгий аэроб, не растет на общепринятых средах, температурный оптимум Зб...37°С, рН 6,7...7,4. Исследуемый материал высевают на среду Френсиса, кровяную среду Емельяновой или желточную Мак-Коя (см. тему 7).

Среда Френсиса: к МПА (рН 7,3) добавляют 0,1 % цистина, 1 % глюкозы, кипятят несколько минут, охлаждают до 50 ºС, до­бавляют 10 % дефибринированной стерильной крови кролика.

Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят 0,1 % цистина, 1 % глюкозы, агар охлаждают до 45 °С и добавляют 10 % стерильной дефибринированной крови.

Посевы культивируют 24...48 ч. Возбудитель формирует мел­кие, круглые, выпуклые, с ров­ными краями, гладкой блестя­щей поверхностью, беловатые колонии (рис. 102). Из подо­зрительных колоний готовят мазки, окрашивают, микроско-пируют. В препаратах из куль­туры в отличие от препаратов из нативного материала клетки возбудителя в основном не кокковидной, а палочковидной формы.

Рис. 102. Колонии F. tularensis (х7)

У культур с типичными для F. tularensis культурально-морфо-логическими признаками исследуют ферментативные свойства (табл. 31).

Выделенную культуру дополнительно идентифицируют с ту-ляремийной иммунной сывороткой в серологических реакциях (РА, ИФА, РП, РИГА).

Биопроба. Выделить культуру F. tularensis посевом на питатель­ные среды удается не всегда. Более эффективен метод заражения белых мышей или морских свинок тканевой суспензией подкож­но или внутрибрюшинно по 0,5 мл. Практикуют проведение 2...3 «слепых» пассажей на чувствительных лабораторных животных. Зараженные животные погибают на 3...5-е сутки, иногда позднее (8... 12-е сутки). У павших животных обнаруживают в паренхима­тозных органах некротические очажки. Из органов путем посева на питательные среды выделяют культуру возбудителя.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить и окрасить по методу Грама (Козловского) мазки из инактивированных клеток бруцелл, F. tularensis. Опи­сать культуральные и морфологические свойства возбудителей.

2. Исследовать в пробирочной РА и роз-бенгал-тесте сыворот­ки крови от здоровых и больных бруцеллезом животных (круп­ный рогатый скот).

3. Освоить технику постановки и учета результатов кольцевой реакции с молоком.

4. Ознакомиться с биопрепаратами для специфической про­филактики и диагностики бруцеллеза.

Контрольные вопросы

1. Какой материал направляют в лабораторию для бактериологического иссле­дования на бруцеллез и туляремию?

2. В чем состоит бактериологическое исследование на бруцеллез и туляремию?

3. Как ставят биопробу на бруцеллез и туляремию?

4. Какие методы применяют для серологической диагностики бруцеллеза?

5. Какие выпускают вакцины против бруцеллеза?