Тема 24 лабораторная диагностика туберкулеза, паратуберкулеза, актиномикоза. Биопрепараты

Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудите­лей, методами лабораторной диагностики туберкулеза и парату-беркулеза, актиномикоза, биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Суспензия микобактерий в смеси со стафилококками, эшерихиями (вакцина БЦЖ), культуры ми­кобактерий на среде Петраньяни (Левенштейна—Иенсена), кра­сители для окраски по методу Циля—Нильсена, биопрепараты.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Туберкулез. Это хроническое инфекционное заболевание до­машних и диких животных, в том числе птиц, а также человека. Характеризуется образованием туберкулов (бугорков) в различ­ных органах и тканях. Наиболее восприимчивы к туберкулезу крупный рогатый скот, свиньи и куры.

Возбудителя туберкулеза относят к роду Mycobacterium, семей­ству Mycobacteriaceae. Наибольшее значение в патологии сель­скохозяйственных животных (и человека) имеют следующие виды: М. tuberculosis — возбудитель туберкулеза человека, М. bovis — возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота, М. avium — возбудитель туберкулеза птиц.

Лабораторная диагностика туберкулеза основана на результа­тах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале (ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии и биопробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным признакам.

Материал для исследования. От павших или убитых с диагнос­тической целью сельскохозяйственных животных берут лимфа­тические узлы — заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные, печеночные, надвымянные, а также кусочки печени, легких и селезенки. Тушки птиц направляют в лабораторию целиком — исследуют пораженные печень, легкие, селезенку, яичники. От живых животных берут пробы молока и спермы. При взятии патологического материала необходимо со­блюдать правила личной безопасности.

Материал доставляют в лабораторию свежим, в замороженном виде или консервируют 30...40%-м водным раствором глицерина. Обсемененность патологического материала микобактериями ту­беркулеза может быть незначительной, поэтому для получения достоверных диагностических результатов специальными мето­дами обработки повышают концентрацию возбудителя. К обра­ботке предъявляют ряд требований: она должна обеспечивать го­могенизацию материала, уничтожать сопутствующую микрофло­ру, быть щадящей для микобактерий туберкулеза и способство­вать их концентрации в материале (обогащение).

Кусочки органов и тканей измельчают, заливают 3...10%-м ра­створом серной кислоты в соотношении 1 : 4, пробу центрифуги­руют при 3000 мин^-1 10... 15 мин. Осадок суспендируют в неболь­шом количестве физиологического раствора и используют для посевов и приготовления мазков для микроскопии (перед посе­вом осадок можно дополнительно отмыть физиологическим ра­створом два-три раза путем центрифугирования).

Пробу молока (150 мл) центрифугируют при 3000 мин^-1 20...30 мин. Осадок обрабатывают 3...6%-м раствором серной кислоты 20…30 мин, тщательно взбалтывают и центрифугируют. Осадок высевают на питательные среды.

Яйца перед исследованием инкубируют в термостате при 37...38 °С 20 дней, после чего содержимое измельчают, обрабаты­вают 3... 10%-м раствором серной кислоты, центрифугируют и осадок используют для посевов и микроскопии.

Для концентрирования микобактерий в исследуемом материа­ле применяют метод флотации. Материал гомогенизируют с фи­зиологическим раствором до консистенции сметаны и 10 мл гомогената вносят в колбу с узким горлом на 250 мл, добавляют 10 мл 1%-го раствора гидроксида натрия. Колбу закрывают и смесь встряхивают в течение 10 мин. Затем смесь разбавляют дис­тиллированной водой в соотношении 1:9 и прибавляют 1...2мл ксилола (петролейного эфира или авиационного бензина), смесь вновь встряхивают в течение 5... 10 мин, добавляют дистиллиро­ванную воду (до горлышка колбы) и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Микотуберкулезные бактерии концентри­руются во флотационном кольце у горлышка колбы вместе с кап­лями ксилола, которые, всплывая на поверхность, увлекают за со­бой и микобактерий. Содержимое образовавшегося кольца ис­пользуют для посевов и приготовления мазков для микроскопии, нанося материал на стекло несколько раз по мере подсыхания.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Микобакте­рий — прямые или слегка изогнутые палочковидные клетки раз­мером (0,2...0,6) х (1...10) мкм, без спор, капсул и жгутиков; грам-положительные, кислото- и спиртоустойчивые. Кислотоустойчивость связана с присутствием в клеточной стенке липидов и ми-коловой кислоты (до 60 %). В цитоплазме располагаются кислотолабильные гранулы, состоящие в основном из метафосфата (зерна Муха). Дилиды и воскоподобные вещества придают микробной клетке гидрофобность, т. е. способность отталкивать воду и водные растворы красителей, кислот, щелочей, в связи с чем бактерии туберкулеза (и паратуберкулеза) плохо восприни­мают окраску. Для окрашивания микобактерий применяют спе­циальные методы, среди которых самый распространенный — метод Циля—Нильсена. По Цилю—Нильсену микобактерий ок­рашиваются в ярко-красный цвет.

В препаратах М. tuberculosis обнаруживают в виде тонких пря­мых (изогнутых) палочек, М. bovis представляет собой короткие и толстые палочки, М. avium мельче остальных видов, со склоннос­тью к полиморфизму (рис. 78).

Рис. 78. Микобактерий в окрашенном препарате из мокроты:

/ — микобактерий; 2 — тканевые элементы

Бактериоскопический метод отличает невысокая чувстви­тельность: с его помощью возбудитель выявляют при концентра­ции микобатерий (1...5)10⁵/мл. Более результативна люми­несцентная микроскопия (ок­раска аурамин-родамином), благодаря которой выявляют даже незначительное количе­ство микобактерий, которые окрашены в бело-желтый цвет, а также формы с измененными тинкториальными свой­ствами.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Микобакте- рии — аэробы, температурный оптимум 37...38 °С, рН 6,4...7. Растут медленно. Для культивирования микобактерий туберкулеза используют сложные питательные среды, содержащие глицерин, картофель, яйца, витамины. Рост бактерий стимулируют аспарагиновая кислота, альбумин, глюкоза, биотин, никотиновая кислота, соли аммония и др. Наиболее часто применяют среды Петраньяни, Левенштейна—Иенсена, Гельберга.

Рост микобактерий бычьего вида на плотных средах чаще обна­руживают на 20...60-е сутки, человеческого вида — на 14...40-е сут­ки, птичьего — на 10...20-е сутки (рис. 79).

Рис. 79. 1,5-месячный рост микобак­терий туберкулеза птичьего типа на среде Петраньяни (штаммные № 6, 15, ЗП, 25)

М. bovis на плотных питательных средах формирует мелкие гладкие шаровидные колонии цвета слоновой кости, иногда с морщинистым сероватым налетом. На жидких средах образует пленку на поверхности сначала в виде единичных островков, по­зднее — сливающихся в сплошную пленку.

М. tuberculosis на плотных питательных средах дает рост в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. У колоний при­поднятый центр, они крошковидные, с приятным запахом, по виду напоминают цветную капусту, плохо смачиваются водой. На жидких средах рост наблюдают на 5...7-е сутки в виде сухой морщинистой пленки, поднимающейся на края пробирок, среда остается прозрачной. На жидких средах и при внутриклеточном развитии образуется корд-фактор (трегалоза-6,6-дипиколат), способствующий сближению бактериальных клеток в микроко­лониях и их расположению в виде серпантинообразных кос, что можно наблюдать при микро­скопическом исследовании (рис. 80). В средах, содержа­щих детергент (твин-80), вследствие потери клетками гидрофобности наблюдают диффузный рост.

Рис. 80. Серпантинообразное распо­ложение клеток микобактерий в мик­рокультуре (корд-фактор)

М. avium на плотных яич­ных средах растет в виде глад­кого маслянистого налета. Колонии округлые, слизистые, мягкие, серовато-бе­лые, с возрастом желтеют, иногда образуют возвыше­ние в виде пуговицы с кратерообразным углублением. При первичной изоляции из патологического матери­ала колонии плоские и по­лупрозрачные. В жидких питательных средах возбу­дитель дает диффузный рост с формированием

влажной жирной пленки и образованием рыхлого осадка. Биохи­мические свойства микобактерий указаны в таблице 20.

Биопроба. Метод применяют не только для обнаружения воз­будителя в исследуемом материале, но и для определения его ви­довой принадлежности. Биопробу ставят параллельно с культу-ральными исследованиями.

Для определения вида заражают двух морских свинок, двух кроликов, при необходимости и двух кур. Перед постановкой биопробы морским свинкам и курам проводят туберкулинизацию. В опыт берут животных, не реагирующих на введение ту­беркулина. Для заражения используют культуру или исследуемый материал, обработанный серной кислотой (см. «Материал для исследования»). Морским свинкам суспензию материала вводят по 1...2 мл подкожно в паховую область, кроликам — внут­ривенно, курам — в подкрыльцовую вену. За подопытными жи­вотными ведут наблюдение, в течение трех месяцев. У морских свинок в положительных случаях через 2...3 нед в месте введения образуется уплотнение, потом язва, увеличиваются регионарные лимфоузлы. Через 30 сут после заражения свинкам повторяют ту-беркулинизацию. При наличии клинических признаков заболе­вания и положительной реакции на туберкулин одну морскую свинку подвергают убою с последующим патологоанатомическим исследованием и приготовлением из пораженных органов маз­ков, которые окрашивают по методу Циля—Нильсена. При обна­ружении в мазках микобактерий туберкулеза дают положитель­ное заключение на туберкулез и биологическое исследование прекращают.

Возбудитель относят к тому или иному виду микобактерий, основываясь на следующих результатах биопробы (табл. 21).

Серологическая диагностика: постановку РСК рекомендуют как дополнительный метод при отборе для диагно­стического убоя животных, положительно реагирующих на ту­беркулин.

Аллергическая диагностика. Не принадлежит к лабораторным методам, но на практике имеет ведущее значение для прижиз­ненного определения инфекции у животных, в том числе у птиц.

Применяют сухой очищенный туберкулин (протеин—пурифиед—дериват: ППД), который вводят крупному рогатому скоту, буйволам, верблюдам, оленям в толщу кожи в области средней трети шеи, свиньям — на наружную поверхность основания уха, курам — в толщу кожи бородки. Реакцию учитывают через 72 ч, измеряя толщину кожной складки с учетом припухлости. Поло­жительной реакцией считают тестоватый отек кожи размерами 35 х 45 мм и более, который на ощупь теплее окружающих тка­ней. Кожная складка увеличивается на 3 мм и более. Для измере­ния кожной складки используют кутиметр. У кур реакцию учи­тывают через 30...36 ч: при положительной реакции бородка опу­хает, становится горячей и отвисает.

Биопрепараты. Вакцина БЦЖ (BCG) представляет собой жи­вую лиофильно высушенную культуру вакцинного штамма ту­беркулезных микобактерий бычьего типа. Вакцинный штамм BCG (Bacillus Calmette — Gueriri) был получен в 1924 г. француз­скими учеными Кальметтом и Гереном путем длительного куль­тивирования (в течение 18 лет) вирулентного штамма М. bovis на картофельно-глицериновой среде с добавлением бычьей желчи. Для приготовления противотуберкулезной вакцины штамм БЦЖ выращивают на специальных средах в течение 20 дней. Приго­товленную вакцину высушивают методом лиофилизации и при­меняют для профилактики туберкулеза у людей (прививают всех новорожденных). В ветеринарной практике вакцину БЦЖ ис­пользуют в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для про­филактики туберкулеза у крупного рогатого скота.

Сухой очищенный туберкулин ППД для млекопитающих го­товят из культуры микобактерий, которую выращивают в течение двух месяцев, а затем стерилизуют автоклавированием. Белок из культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой. Преципитат белка, отделенный центрифугированием, растворя­ют в воде и вновь осаждают сульфатом аммония. Белок — это ос­новная фракция туберкулина ППД, содержание белка составляет 73,4...90 %. Кроме того, в состав препарата входят полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты.

Альттуберкулин (АТК) для млекопитающих — это стерильный фильтрат культуры микобактерий, выращенных в течение двух месяцев на мясо-гидролизатном картофельно-глицериновом бу­льоне. Бульон концентрируют, выпаривая до 1/10 первоначаль­ного объема, и затем добавляют 20 % экстракта бактериальной массы микобактерий.

ППД-туберкулин для птиц готовят, используя пять штаммов М. avium. Выделение белка из культуральной жидкости и приго­товление препарата проводят, как при получении АТК.

Сухой очищенный комплексный аллерген из атипичных ми­кобактерий (КАМ) готовят во ВГНКИ по типу ППД-туберкули-на. Симультанную пробу КАМ используют в качестве дополни­тельного метода диагностики в благополучных по туберкулезу хо­зяйствах. Туберкулины контролируют на стерильность, безвред­ность, специфичность и активность.

Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит). Хроническая бо­лезнь крупного рогатого скота, реже овец. Характеризуется нару­шением деятельности желудочно-кишечного тракта, приводя­щим к истощению и гибели животного

Возбудитель паратуберкулеза — М. paratuberculosis, род Mycobacterium, семейство Mycobacteriaceae.

Лабораторная диагностика паратуберкулеза основана на ре­зультатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии (микроско­пия — это основной метод), выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культу-рально-морфологическим признакам.

Материал для исследования. От павших или убитых с диагнос­тической целью животных берут пораженные участки подвздош­ной кишки — утолщенные, с выраженной складчатостью слизис­той оболочки и брыжеечные лимфоузлы. От живых животных в лабораторию направляют фекалии с примесью слизи и крови и соскобы со слизистой оболочки прямой кишки.

Микроскопия препаратов из исходного материала. В мазках, ок­рашенных по методу Циля—Нильсена, возбудители паратуберку-леза темно-красного цвета, палочковидной формы, размером (0,6...2) х (0,2...0,5) мкм. Для старых культур характерен полимор­физм: палочки могут быть расширенными или в виде глыбок, кокков. В мазках из патологического материала клетки распола­гаются кучками в виде «палисада» (частокола). Возбудитель не­подвижен, не образует спор и капсул, кислотоустойчив.

Кроме световой применяют также люминесцентную микро­скопию мазков-отпечатков из патологического материала, окра­шенных флуорохромами, как при туберкулезе.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Культиви­рование и выделение чистой культуры возбудителя сопряжены с большими трудностями. В питательные среды добавляют (до 1...4%) ростовой фактор микобактин — спиртовой экстракт из микобактерий флей (тимофеевой травы) или же экстракт из ми­кобактерий других видов. По типу дыхания возбудитель — аэроб, температурный оптимум 38 °С.

В жидких питательных средах образует нежную беловатую пленку, которая через З...4мес опускается на дно пробирки. На плотных питательных средах через 1,5...2мес вырастают сухие сморщенные беловато-серые или желтоватые колонии.

Биопроба. При паратуберкулезе этот метод не применяют, так как лабораторные животные к возбудителю невосприимчивы.

Серологическая диагностика основана на ис­следовании в РСК: реакцию ставят с пробами сывороток крови от больных животных по общепринятой методике.

Аллергическая диагностика. Метод, применяемый в хозяйствах. Для аллергической диагностики паратуберкулеза у крупного ро­гатого скота используют альттуберкулин для птиц, стандартный сухой очищенный туберкулин ППД для птиц и паратуберкулин, у овец — сухой очищенный туберкулин ППД для птиц.

Актиномикоз. Хроническая бактериальная инфекция; характе­ризуется образованием в различных тканях плотных, четко огра­ниченных припухлостей — актиномиком, подверженных некро­тическому распаду (рис. 81). Восприимчивы различные виды жи­вотных и человек. Возбудитель — бактерия из группы актиномицет — Actinomyces bovis. У человека актиномикоз вызывает A. Israeli.

Лабораторная диагностика актиномикоза основана на резуль­татах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют пора­женные лимфатические узлы, стерильно взятый гной из абсцес­сов.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Для приго­товления препаратов в материале находят твердые серовато-бе­лые зернышки с зеленоватым оттенком — друзы, которые пред­ставляют собой скопление клеток возбудителя. Их промывают в дистиллированной воде и переносят на предметное стекло в кап­лю 10...20%-го раствора гидроксида натрия или калия, выдержи­вают 15 мин или слегка подогревают над пламенем горелки. Ок­рашивают по Граму. Затем наносят каплю 50%-го водного ра­створа глицерина, накрывают препарат покровным стеклом и ис­следуют под малым увеличением микроскопа или с помощью иммерсионной системы. При микроскопировании заметен гомо­генный центр друзы, состоящий из густо переплетенных ните­видных палочек, булавовидно утолщающихся к периферии (рис. 82). Центр друзы окрашен грамположительно, а перифери­ческая часть — грамотрицательно. Такая микроскопическая кар­тина характерна и имеет диаг­ностическое значение. Друзы в экссудате могут быть не всегда, несмотря на наличие отдельных клеток.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель — факультативный анаэроб, температурный оптимум 37...38 ºС. Материал высевают на МПА, содержащий 1 % глюкозы, ПЖА с 1 % глюкозы, кро­вяной или сывороточный агар.

Макроскопически видимые колонии появляются через 7…14 дней, иногда 15...30 дней культивирования. Колонии на МПА с глюкозой первоначально белые, мягкой консистенции, с ровными краями, иногда с кли­новидными выступами по периферии. Со временем колонии приобретают светло-коричневую окраску. При выращивании в анаэробных условиях формируются гладкие, выпуклые, непроз­рачные, влажные колонии, на кровяном МПА вокруг колоний образуется слабая зона гемолиза. В мазках из культур, выращен­ных в аэробных условиях, обнаруживают нити и цепочки из грамположительных палочек, в анаэробных — короткие палочки.

У выделенных культур изучают ферментативную активность: возбудитель разжижает желатину, ферментирует с образованием кислоты глюкозу, левулезу, галактозу, глицерин.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить мазки из смеси бактерий, окрасить по методу Циля—Нильсена, промикроскопировать, зарисовать.

2. Описать характер роста микобактерий на питательных сре­дах.

4. Ознакомиться с биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1. Какова таксономическая характеристика возбудителей туберкулеза и парату­беркулеза?

2. Каковы морфологические и тинкториальные особенности возбудителей ту­беркулеза и паратуберкулеза?

3. В чем состоят культуральные особенности возбудителей туберкулеза и пара­туберкулеза?

4. По каким свойствам дифференцируют возбудителей туберкулеза и парату­беркулеза?

5. В чем заключается лабораторная диагностика актиномикоза?