2. Индукция синтеза белков. Lac-оперон

Теория оперона была предложена на основании данных, полученных при изучении свойств лактозного оперона (laс-оперона) Е. coli, т.е. оперона, в котором закодированы белки, участвующие в усвоении лактозы.

Клетки Е. coli обычно растут на среде, используя в качестве источника углерода глюкозу. Если в среде культивирования глюкозу заменить на дисахарид лактозу, то по прошествии нескольких минут клетки адаптируются к изменившимся условиям. Они начинают продуцировать 3 белка, обеспечивающих утилизацию лактозы. Один из этих белков - фермент β-галактозидаза, катализирующий гидролитическое

расщепление лактозы до глюкозы и галактозы.

В присутствии глюкозы клетки Е. coli содержат менее 10 молекул этих ферментов на клетку. Перенос клеток на среду, содержащую лактозу, вызывает индукцию - увеличение количества молекул каждого из ферментов до 5000 (рис. 4-47).

Теория оперона объясняет это явление следующим образом. В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. А поскольку участки оператора и промотора перекрываются, то присоединение репрессора к оператору препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором, и транскрипция структурных генов оперона не идёт. Когда в среде появляется индуктор, т.е. лактоза, то он присоединяется к белку-репрессору, изменяет его конформацию и снижает сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены.

Механизмы регуляции экспрессии генов у эукариотов

Эукариотические организмы (и особенно млекопитающие) устроены значительно сложнее прокариотов и нуждаются в более сложном аппарате регуляции. Так, в организме человека имеется более 200 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям. В то же время различными методами исследования ДНК (прежде всего, методом молекулярной гибридизации) доказано, что количество и структура ДНК практически всех клеток организма одинаковы (за исключением лимфоцитов), т.е. все клетки организма содержат один и тот же геном. У высших организмов по сравнению с прокариотическими существенно возрастает содержание ДНК на гаплоидную клетку: с 4,2×106 пар нуклеотидов у Е. coli до 3,3×109 пар нуклеотидов в клетках человека.

Рис. 4-47. Механизм индукции лактозного оперона. А - в отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. РНК-полимераза не может присоединиться к промотору, транскрипция структурных генов оперона не идёт; Б - в присутствии лактозы белок-репрессор присоединяет её, изменяет свою конформацию и теряет сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены: β-галактозидазы (А), катализирующей гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы; галактозидпермеазы (В), осуществляющей транспорт лактозы и других галактозидов в клетки; тиогалактозидтрансацетилазы (С) - фермента, способного переносить ацетильную группу ацетил-КоА на тиогалактозу. Функция его в процессе утилизации лактозы пока неясна.

Рис. 4-48. Механизм репрессии синтеза ферментов, участвующих в образовании гистидина. А - в отсутствие корепрессора (гистидина) белок-репрессор не имеет сродства к оператору, РНК-полимераза присоединяется к промотору, и происходит транскрипция 10 структурных генов, кодирующих строение ферментов, участвующих в синтезе гистидина; Б - в присутствии гистидина в среде комплекс белка-репрессора с корепрессором, т.е. Гис, связывается с оператором, препятствует присоединению РНК-полимеразы к промотору и останавливает транскрипцию.

Амплификация (или увеличение числа) генов используется организмом в том случае, когда возникает необходимость увеличить синтез определённого генного продукта. Многие гены, кодирующие белки или РНК, необходимые организму в больших количествах (например, гистоны, рРНК, тРНК), постоянно присутствуют в амплифицированном соетрянии. Так, у человека 20% общего генома состоит из участков, кодирующих рибосомные, транспортные и ядрышковые РНК, последние из которых обеспечивают посттранскрипционные модификации РНК. Амплифицированные участки могут располагаться друг за другом (тандемно) в хромосоме или образовывать внехромосомные фрагменты ДНК, называемые двойными мини-хромосомами, их размер колеблется от 100 до 1000 килобаз (1 килобаза = 1000 пар нуклеотидов). Описано более 20 генов, способных амплифицироваться при определённых условиях.

К числу генов, для которых обнаружена амплификация, относят ген металлотионеина. Продукт экспрессии этого гена - низкомолекулярный белок металлотионеин, обладающий способностью связывать тяжёлые металлы (медь, цинк, кадмий, ртуть) и защищать клетки от отравления этими соединениями. Установлено, что в ответ на повышение концентрации тяжёлых металлов в крови в клетках происходит амплификация гена металлотионеина.

Другими примерами генов, количество которых увеличивается под влиянием лекарственных препаратов, являются ген дигидрофолатредуктазы (см. разделы 9, 10) и ген Р-гликопротеина, ответственный за синтез белка, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток (см. раздел 16).

* Утрата генетического материала - довольно редкий способ регуляции. Наиболее яркий пример потери всех генов за счёт разрушения ядра - процесс созревания эритроцитов. Нестабильны амплифицированные гены, двойные хромосомы. Они, как правило, исчезают в последующих генерациях. Утрата генетического материала происходит в процессе созревания лимфоцитов и образования плазматических клеток разных клонов, синтезирующих секретируемые формы иммуноглобулинов.

Механизмы мутаций и репараций ДНК.

Изменения в последовательности пуриновых или пиримидиновых оснований в гене, не исправленные ферментами репарации, получили название "мутации". Одни из них остаются в соматических клетках, в которых они возникли, а другие обнаруживаются в половых клетках, передаются по наследству и могут проявляться в фенотипе потомства как наследственная болезнь.

Существенный вклад в генетическую изменчивость вносят перестройки хромосом в процессе мейоза. Как уже указывалось ранее, слияние яйцеклетки со сперматозоидом у эукариотов сопровождается генетическими рекомбинациями, в ходе которых происходит обмен участками ДНК между гомологичными хромосомами. Это приводит к появлению потомства с новой комбинацией генов.

Ген или части генов могут перемещаться из одного места хромосомы в другие. Эти подвижные элементы или фрагменты ДНК получили название транспозонов и ретротранспозонов.

Транспозоны - участки ДНК, удаляемые из одного локуса хромосомы и встраиваемые в другой локус той же или другой хромосомы. Ретротранспозоны не покидают исходного положения в молекуле ДНК, но могут копироваться, и копии встраиваются, подобно транспозонам, в новый участок. Включаясь в гены или участки около генов, они могут вызывать мутации и изменять их экспрессию.

Геном эукариотов подвергается изменениям и при заражении ДНК- или РНК-содержащими вирусами, которые внедряют свой генетический материал в ДНК клеток хозяина.

Таблица 4-7. Классификация мутаций

Тип мутаций	Характер мутационных изменений	Примеры последствий
Геномный	Изменение числа хромосом	Болезнь Дауна (появление дополнительной хромосомы 21)
Хромосомные	Общее число хромосом не меняется. Наблюдают перестройки хромосом, обычно видимые при микроскопическом исследовании.	Мышечная дистрофия Дюшенна (делеции Х-хромосомы)
Генные	Изменения затрагивают один кодон или небольшой отрезок гена и не обнаруживаются цитогенетически	Серповидно-клеточная анемия, вызванная заменой одного нуклеотида в гене β-цепи глобина

Генные, или точечные, мутации бывают в основном 3 видов:

* замены, при которых одно азотистое основание в ДНК замещается на другое;

* вставки, обеспечивающие внедрение в молекулу ДНК одного или нескольких дополнительных нуклеотидов;

* делеции (или выпадения) одного или нескольких нуклеотидов, при которых происходит укорочение молекулы ДНК.

1. Мутации по типу замены возникают в результате замены одного азотистого основания на другое, что вызывает изменение в одном из кодонов мутантного гена. Если кодирующий триплет, в котором находится изменённый нук-леотид, из-за вырожденности кода вызывает включение в белок той же аминокислоты, что исходный кодон (или кодон "дикого" типа), то такую мутацию называют "молчащей", и белковый продукт остаётся тем же.

	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-GGT-5'	3'-GGA-5'
Кодон мРНК	5'-ССА-3'	5'-CCU-3'
Аминокислота	-Про-	-Про-

Когда замена одного основания приводит к замене аминокислоты в мутантом белке, то такую мутацию называют "миссенс-мутация". В ряде случаев, несмотря на произошедшую замену, белок сохраняет биологическую активность. Это, как правило, связано с тем, что изменённая аминокислота находится в участке белка, не имеющем функционального значения, и к тому же она по структуре и свойствам напоминает исходную аминокислоту. Такая мутация тоже будет "молчащей", а замена - эквивалентной.

	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-ТАА-5'	3'-GAA-5'
Кодон мРНК	5'-AUU-3'	5'-CUU-3'
Аминокислота	-Иле-	-Лей-

Иногда аминокислота, оказавшаяся заменённой, располагается в области, важной для проявления функциональной активности белка, и её замещение приводит к образованию функционально неактивного продукта. Так, точечная мутация в кодоне серина (Сер - важнейший структурный компонент активного центра сериновых протеаз: трипсина, химотрипсина и некоторых других ферментов) приводит к полной потере активности. Если подобный фермент участвует в реакциях главных метаболических путей, то такая "неэквивалентная" замена может стать летальной.

	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-АGА-5'	3'-АAA-5'
Кодон мРНК	5'-UCU-3'	5'-UUU-3'
Аминокислота	-Cер-	-Фен-

В ряде случаев мутантный белок, несмотря на входящую в него изменённую аминокислоту, сохраняет способность вьшолнять свою функцию, но может быть Не столь эффективным, как белок "дикого" типа. В результате мутации у фермента может оказаться более высоким значение Кm или более низким значение Vmax, а иногда то и другое одновременно. Такие частично функционирующие белки называют мутантными белками с неполностью подавленной функцией.

Изредка в результате мутации белковый продукт гена оказывается лучше приспособленным к выполнению своей функции. Такие мутации дают потомству преимущества в борьбе за существование, а серия соответствующих мутаций может привести к появлению нового вида.

Наибольшим повреждающим действием обладают мутации, приводящие к образованию одного из терминирующих кодонов (нонсенс-мутация). В процессе синтеза белка работа рибосомы будет остановлена на мутантном триплете мРНК: UAA, UAG или UGA. Проявление нонсенс-мутаций зависит от их внутригенной локализации. Чем ближе мутация к 5'-концу гена, т.е. к началу транскрипции, тем короче её белковый продукт, а следовательно, тем меньше он способен к осуществлению биологической функции.

	Триплет "дикого" типа	Изменённый триплет
Матрица ДНК	3'-GTC-5'	3'-АTC-5'
Кодон мРНК	5'-CAG-3'	5'-UAG-3'
Аминокислота	-Глн-	-Стоп-кодон-