27. Люминисцентная микроскопия. Сущность, методы обработки препаратов.

Люминесцентная микроскопия (микроскопическое изучение люминесцирующих объектов в ультрафиолетовом свете с помощью специального люминесцентного микроскопа, снабженного источником ультрафиолетовой радиации и соответствующими светофильтрами) – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.

При взаимодействии света с веществом может происходить преломление световых лучей и их рассеяние, либо поглощение фотонов молекулами, или то и другое вместе. Если произошло поглощение кванта света, то через 10-9с может происходить испускание части поглощённой энергии в виде кванта света с большей длиной волны: такое излучение называется люминесценцией. Различают собственную (первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную (наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем.

Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток.

У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентно-микроскопические исследования и для избирательного выявления определённых структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы. Известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся красители: тиазоловые, хинолиновые, азокрасители и особенно акриловые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (берберин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензаантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведённых водных или спиртовых растворах (от 1:1000 до 1:100000).

Флуорохромирование проводят либо прижизненно, либо на фиксированных препаратах.

Методы: флюорохромирования и флюорисцирующих АТ (прямой, непрямой)

28. Метод Флюорохромирования.

МФ основан на окрашивании мазков спец флюорохромными красителями (ФИТЦ). После окрашивания мазок помещают под люм микроскоп, где благодаря ртутно-кварцевым лампам на мазок направляется пучок УФ-лучей, и исследователь в объектив видит светящиеся тельца включения в ядре либо в цитоплазме клетки.

29. Метод флюоресцирующих ат.

МФА основан на специфич свечении образовавшегося комплекса (АГ+АТ) и по существу является аналогом серологической реакции (есть прямой и непрямой, см. 30 и 31)

30. Прямой метод флюоресцирующих ат.

Для работы используют мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы. Предполагают, что имеется возбудитель, который является АГ, поэтому на мазок наносят предположит специфич сыворотку (данному возбудителя), меченую флюорохромным красителем (ФИТЦ), препарат помещают в чашку Петри, туда кладут кусок ваты, смоч водой (влажная камера), чашку пом в термостат при темп 37 на 30 мин, препарат вынимают, промывают водой, высушивают и смотрят под иммерс увелич люмин микроскопа. В + случае (АГ и АТ специфичны) обр светящийся комплекс, в – случае – тёмное поле, тк флю АТ смываются при проиывании. Недостаток: необходимо иметь в наличии специфич флюорохр сыворотки на кажд возбудителя болезни (дорогие, малый срок хранения).