4. Реакция фотолиза.

Фотопревращение или фотолиз родопсина включает собственно фотохимическую реакцию и последующие темновые, зависящие от температуры превращения. Единственной фотохимической реакцией зрения является цистранс изомеризация хромофорной группы – 11-цис-ретиналя. Эта реакция происходит с уникально высокой скоростью – менее чем за 200 фс. За это время образуется первый фотопродукт – фотородопсин, в котором 11-цисретиналь уже перешел в полностью-транс форму, но продолжает быть ковалентно связанным с белком. До сих пор остаётся неясным, почему скорости фотоизомеризации ретиналя как хромофора увеличивается почти на два порядка по сравнению со скоростью его фотоизомеризации в растворе. Роль белкового окружения в этих процессах не вызывает сомнения, однако внутримолекулярные механизмы, объясняющие этот феномен, остаются до конца не изученными.

Фотородопсин за 40–45 пикосекунд переходит в следующий продукт – батородопсин. На этой стадии происходят лишь небольшие структурные изменения в ближайшем белковом окружении ретиналя. Образо- вание батородопсина сопровождается стабилизацией значительной части энергии поглощенного кванта света, которая затем тратится на последующие конформационные (структурные) перестройки всей белковой части молекулы родопсина. Батородопсин затем в течение нескольких десятков наносекунд переходит в следующий продукт – люмиродопсин. Наэтой последующих стадиях в белке происходят уже существенные конформационные изменения. Люмиродопсин превращается далее в метародопсин I и тот, наконец, в метародопсин II. Максимум спектра поглощения метародопсина I находится при 380 нм, то есть в УФ-области спектра, хотя его довольно широкий спектр поглощения захватывает и синюю

область видимого спектра. Метародопсин II и представляет собой тот промежуточный, долгоживущий продукт фотопревращения родопсина, который приобретает способность к взаимодействию с G-белком (трансдуцином).

Процесс фотопревращения (фотолиза) родопсина завершается разрывом ковалентной химической связи теперь уже полностью-транс ретиналя с белком. Таким образом, ретиналь высвобождается из белка и

оказывается в фосфолипидном окружении фоторецепторной мембраны. Ретиналь должен быть как можно скорее удален из мембраны, так как в противном случае он может стать источником опасности сначала для зри-

тельной клетки, а затем и для клеток пигментного эпителия. Зрительный цикл обеспечивает эффективное удаление полностью-транс ретиналь из фоторецепторной мембраны с тем, чтобы затем снова вернуть его в эту мембрану, но уже в 11-цис изомерной форме .Только этот изомер обладает способностью «войти», как ключ в замок, в хромофорный центр («хромофорный карман») белковой части молекулы (опсина) и вновь образовать ковалентную химическую связь с 296-м лизиновым аминокислотным остатком в его седьмой α-спирали.

5. Ранний и поздний рецепторный потенциал.

После быстрой и достаточно интенсивной вспышки света, вызывающей фотовозбуждение нескольких процентов родопсина, на сетчатке с практически нулевой латентностью может быть зарегистрировано появление раннего рецепторного потенциала (РРП), который существует всего лишь несколько миллисекунд после прекращения светового стимула. Амплитуда РРП пропорциональная числу фотовозбужденных молекул родопсина, а насыщение ответа достигается лишь при очень интенсивных вспышках света, вызывающих фотовозбуждение всех имеющихся в наличии молекул родопсина. РРП, регистрируемый на клочках сетчатки, генерируется в плазматической мембране НСП (наружного сегмента палочки), и его величина может достигать нескольких микровольт .При температуре тела млекопитающих РРП состоит преимущественно из одной отрицательной волны (R2-компонент). Снижение температуры сопровождается появлением еще одного компонента противоположного направления (R1), который предшествует R2-волне, - форма РРП становится бифазной. Не вызывает сомнений, что РРП возникает как следствие смещения зарядов в фоторецепторной мембране в процессе фотолиза родопсина R1-компонент РРП устойчив к температуре и может быть зарегистрирован при ее снижении даже до -35°С. Появляется этот компонент не позднее, чем стадия фотолиза батородопсин-люмиродопсин. R2-компонент чувствителен к температуре и подавляется примерно при 0° С, когда блокируется переход мета I-мета II-родопсин. Возникновение R2-компонента РРП связывают именно с этой стадией фотолиза родопсина.

Поздний рецепторный потенциал (ПРП) – это и есть тот гиперполяризационный ответ фоторецептора, о котором говорилось в предыдущем разделе и который обусловлен подавлением входящего в наружный сегмент натриевого тока. Если РРП после света выявляется в миллисекундной шкале практически с нулевой латентностью, то ПРП развивается с заметной задержкой. Его продолжительность – от момента возникновения до исчезновения – составляет величину от сотен миллисекунд до нескольких секунд. Сказанное справедливо как для палочек, так и для колбочек позвоночных животных. Что касается беспозвоночных, то у них световой стимул тоже вызывает появление ПРП, но здесь – это деполяризационный, а не гиперполяризационный ответ. (В дальнейшем речь пойдет только о палочках сетчатки позвоночных животных).

ПРП – первый функционально значимый этап электрофизиологического ответа фоторецепторной клетки на световой стимул. Потенциал покоя, или темновой потенциал, на плазматической мембране палочки составляет в среднем -30 мВ (минус внутри клетки), но он может быть и выше или ниже: от -10 до -45 мВ в зависимости от вида животного. Величина вызванной светом гиперполяризации плазматической мембраны, т.е. амплитуда ПРП, может достигать примерно 40 мВ. При фотовозбуждении единичной молекулы родопсина, присутствующей в одном из фоторецепторных дисков, наблюдается локальное изменение проводимости (и соответственно потенциала) плазматической мембраны в ее участке, соседствующем с данным диском. Исходно ширина такой полосы составляет несколько микрометров, но затем изменение потенциала быстро распространяется по всей клеточной мембране в виде пассивного перераспределения заряда. При этом свойства плазматической мембраны таковы, что распространение ПРП от НСП к внутреннему сегменту происходит без значительного ослабления. Достигнув синаптического окончания, гиперполяризационная волна модулирует скорость секреции нейромедиатора в синаптическую щель. Интересно, что и здесь фоторецепторная клетка ведет себя не так, как обычные нейроны. В "нормальных" нервных клетках возбуждение сопровождается деполяризацией мембраны аксона и стимуляцией секреции нейромедиатора в пресинаптическое окончание. В фоторецепторе же в состоянии покоя происходит постоянное выделение нейромедиатора из синаптического окончания, тогда как при возбуждении клетки и гиперполяризации ее плазматической мембраны секреция нейромедиатора подавляется. На темноадаптированных палочках эти изменения могут быть зарегистрированы даже при поглощении единственного фотона на клетку. Возрастание числа поглощенных квантов ориентировочно до 30 на темноадаптированный фоторецептор сопровождается линейным увеличением амплитуды ответа. При дальнейшем росте интенсивности вспышек наблюдается отклонение от линейной зависимости, и при световом потоке, равным приблизительно 100 или более фотонам на клетку, достигается насыщение ответа. График зависимости амплитуды ответы (А) от интенсивности световой вспышки (И) представляет собой гиперболу и может быть удовлетворительно описан уравнением, аналогичным уравнению Михаэлиса: А = Амакс.*И/И+К, где Амакс. – максимальная амплитуда при насыщении ответа, К – интенсивность света, вызывающая 50%-ный ответ. Таким образом, гемноадаптированная палочка может работать в режиме счетчиков квантов, перекрывая диапазон интенсивности светового потока примерно в две логарифмические единицы.