1. Спектр испускания флуоресценции

Спектр испускания представляет собой зависимость интен­сивности испускания от длины волны (или волнового числа) при фиксированной длине волны воз­буждающего света. При строгих количественных измерениях спектры.

Форма спектра испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждающего света, поскольку испускание практически всегда происходит с нижнего колебательного подуровня возбужденного электронного состояния. Если вид спектра флуоресценции меняется с изменением длины волны возбуждающего света, это может быть следствием того, что в смеси содержится несколько флуоресцирующих компонентов.

Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества. Поэтому измерения флуоресценции можно использовать для определения концентраций. Минимальные измеряемые концентрации составляют около 10^-12 г/литр, т.е. этот метод в 100-1000 раз чувствительнее, чем абсорбционная спектроскопия.

2. Спектр возбуждения флуоресценции

Спектром возбуждения называ­ют зависимость интенсивности испускания флуоресценции от длины волны (или волнового числа) возбуждающего света при постоянном потоке фотонов, падающих на образец. Важно, что длина волны испускания при регистрации спектра возбуждения остается неизменной, а значения длины волны возбуждения (волновых чисел линии возбуждения) пробегают значения заданного диапазона. Измеряемой величиной является интенсивность испускания флуоресценции, но в спектре ось ординат называют интенсивностью возбуждения флуоресценции.

При измерениях спектра возбуждения должно быть соблюдено условие постоянства потока фотонов возбуждения, попадающих на образец, независимо от длины волны возбуждения. Так как не существует источников света с постоянной по длине волны интенсивностью излучения, идеальный флуориметр должен компенсировать изменение интенсивности возбуждающего света с длиной волны.

В современных приборах такая процедура осуществляется следующим способом. Небольшая часть возбуждающего света после прохождения монохроматора возбуждения отклоняется в сторону с помощью делительной пластинки, и ее интенсивность регистрируется дополнительным детектором (фотодиодом или ФЭУ). Зарегистрированный сигнал (интенсивность испускания на фиксированной длине волны) с основного детектора (как правило, это ФЭУ) нормируется на интенсивность возбуждающего света по результатам измерения дополнительного детектора.

Динамическое рассеяние света (ДРС)

1. История открытия динамического рассеяния света

В начале ХХ века трудами Леона Бриллюэна и Леонида Исааковича Мандельштама было найдено, что интенсивность света, рассеянного ансамблем макромолекул, должна быть промодулирована спонтанными флуктуациями плотности. В 1964 году Р. Пекора теоретически показал, что в оптическом спектре излучения света, рассеянного диффундирующими частицами, содержится информация как о трансляционной, так и о вращательной диффузии. С использованием лазеров и быстродействующих временных анализаторов интенсивности света (корреляторов) в практике молекулярной биологии появилась возможность методом динамического рассеяния света (ДРС) в считанные минуты опрeдeлять коэффициенты поступательного трения. Было показано, что коэффициeнты вращательного трения очень асимметричных молекул и спектр мод внутренних движений гибких молекул могут быть определены методом ДРС в том случае, если их размеры сравнимы с длиной волны света. Кроме того, эффективность примeнeния этого метода сильно возрастает по мeрe увeличeния молекулярной массы изучаемой молекулы. В методе локализованного ДРС лазерный пучок фокусируется на одиночной частице микронных размеров. Спектр колебаний такой одиночной частицы во времени и его изменение под действием сил различной природы может быть изучен методом временных корреляционных функций.