Среды для культивирования микроорганизмов

Основные термины. Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием, а развивающиеся в результате микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензии, осадок или пленку, при развитии в плотной среде – колонии. Культура может быть чистой, т.е. содержит потомство клетки только одного вида, и накопительной, т.е. состоять преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов.

Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культур называют посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом.

Бактерии выращивают на естественных и искусственных питательных средах. Естественные среды (молоко, сусло-агар, сиропы и др.) имеют несбалансированное соотношение компонентов, их состав полностью не изучен. Искусственные питательные среды включают вещества в строго определенных соотношениях с учетом потребностей данного вида в питательных веществах, ростовых добавках, солях и т.п.

Среды различаются в зависимости от консистенции, состава и назначения: по консистенции — плотные, полужидкие и жидкие; по составу — простые, сложные органические и синтетические (искусственные); по назначению — специальные, элективные и дифференциально-диагностические.

В качестве жидких сред используют мясо - пептонный бульон (МПБ), обезжиренное молоко, пивное сусло, дрожжевые среды, бобовый отвар.

Пептон - первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой.

Плотные питательные среды используют для учета количества бактерий, выделения чистой культуры и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя гелеобразные вещества: 1,5…2,5% агар-агара или 10...15% желатина. При приготовлении полужидких сред вносят 0,1...0,2 % агар-агара. Так получают мясо - пептонный агар, мясо - пептонный желатин, картофельный агар, сусло-агар.

Эти простые питательные среды применяют для выращивания многих бактерий.

Агар-агар - это растительный полисахарид, получаемый из некоторых морских водорослей.

Желатин - кислый азотсодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, но не изменяющийся объем жидкой питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы. Это в дальнейшем приводит к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура - непрерывной.

Рост периодической культуры бактерий подразделяют на несколько фаз, или периодов: 1) лаг-фаза; 2) фаза логарифмического роста; 3) фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; 4) фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования (рис.3.2).

Лаг-фаза (от англ. lаg — запаздывание) — период между посевом бактерий и началом их размножения. Продолжительность лаг-фазы составляет в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению, активизируются ферменты, повышается количество нуклеиновых кислот, особенно РНК (что необходимо для синтеза белков), белка и других компонентов клетки.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий продолжительностью около 5—6 ч. Клетки размножаются с максимальной для данной культуры скоростью (т.к. еще не действуют лимитирующие факторы). При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин (время генерации — интервал между делениями клетки). Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, особенностей их культивирования.

В ходе интенсивного роста и размножения внутри закрытой системы возрастает негативное влияние лимитирующих факторов: истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Наступает фаза гибели, характеризующаяся отмиранием клеток. Продолжительность этой фазы колеблется от десятков часов до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе от оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Если к бактериям постоянно добавлять питательную среду и одновременно удалять продукты обмена, можно поддерживать бактериальную культуру в логарифмической фазе роста. Для этого применяют хемостат.

Методы культивирования микроорганизмов

Культивирование продуцента обычно называют ферментацией. Различают следующие виды аэробной и анаэробной ферментации: глубинная, поверхностная, периодическая, непрерывная, с иммобилизованным продуцентом и др. (рис. 5).

Рис. 5. Методы ферментации

Основные показатели процесса ферментации

Для оценки реального ферментационного процесса используют ряд кинетических показателей. Практически в ферментационной среде контролируют содержание основных субстратов S (обычно источник углеводов), биомассы X и целевого продукта Р. По этим показателям вычисляют удельную скорость роста , продуктивность системы по биомассе Q_X и продукту Q_P, а также, при необходимости, экономические коэффициенты.

1. удельная скорость роста:

 = X₁ – X₀

X₁ (t_{1 –} t₀)

2. продуктивность системы по биомассе Q_X:

Q_X = X₁ – X₀

t_{1 –} t_o

3. продуктивность системы по продукту Q_P:

Q_P = P₁ – P₀

t_{1 –} t₀