3. Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы.

Принцип метода. Вещества, усиливающие действие Ферментов, называются активаторами. Вещества с противоположным действием — ингибиторы. Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия — специфического активатора амилазы. Сернокислая медь оказывает тормозящее действие на активность амилазы.

Реактивы: слюна в разведении 1:3; крахмал, 1 % раствор; раствор Люголя; хлористый натрий, 1 % раствор; сернокислая медь, 1 % раствор.

Ход работы: В три пробирки приливают по 3 мл раствора слюны в разведении 1:3. В первую пробирку добавляют 1 каплю 1 % раствора хлористого натрия, во вторую — 1 каплю 1% раствора сернокислой меди, в третью — 1 каплю воды. После этого в каждую пробирку приливают по 5 капель 1% раствора крахмала. Все пробирки оставляют при комнатной температуре на 3—5 минут. С содержимым каждой пробирки проделывают реакцию на крахмал, приливая по 1 капле раствора йода в йодистом калии. Записывают результаты опыта и делают выводы.

4. Активность α-амилазы слюны (количественное определение).

Принцип метода. Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в миллилитрах, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при температуре 38°С в течение 30 минут. В норме амилазная активность слюны равна 160—320. Амилазная активность обозначается А 38⁰/30’. Этот метод широко используется для определения амилазной активности крови и мочи.

Реактивы: крахмал 0,1% раствор; раствор Люголя; слюна в разведении 1:9.

Ход работы: В 10 пробирок наливают по 1 мл воды и в первую из них добавляют 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью и т.д. до 10-ой пробирки. Из 10-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Во все пробирки наливают 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при 38⁰С на 30 минут, после инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой, добавляют по 1 капле раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. Отмечают последнюю пробирку с желтоватой окраской, где гидролиз крахмала прошёл полностью. И делают расчёт, полученные данные заносят в таблицу.

Номер пробы	Разведение	Окраска раствора с йодом	Выводы
1	1:20
2	1:40
3	1:80
4	1:160
5	1:320
6	1:640
7	1:1280
8	1:2560
9	1:5120
10	1:102040

Расчёт. Отметив пробирку, где гидролиз крахмала прошёл полностью при наименьшем количестве фермента, по количеству не разведенной слюны в данной пробирке рассчитывают амилазную активность слюны по следующей пропорции:

А мл слюны расщепило 2 мл 0,1% раствора крахмала,

1 мл слюны расщепил Х мл 0,1 % раствора крахмала,

где А – количество неразведенной слюны.

Например, желтоватая окраска появляется в 4-й пробирке, где слюна была разведена в 160 раз; 1/160 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала; 1 мл неразведенной слюны расщепил Х мл 0,1% раствора крахмала: Х=2*1*160/1=320 мл 0,1% раствора крахмала.

Следовательно, амилазная активность слюны А 38⁰/30’ равна 320.