Лабораторная работа № 6 ферменты.

Теоретическая часть.

Ферменты или энзимы — специфические белки, которые играют роль биологических катализаторов. Они входят в состав клеток и тканей живых организмов. Благодаря ферментам обмен веществ протекает с большой скоростью при обычной температуре тела и без участия сильнодействующих химических реагентов.

Белковую часть сложных белков ферментов; называют апоферментом, а небелковую часть — кофактором. Кофактор условно разделяют на кофермент (коэнзим), легкодиссоциирующую и простетическую группу, труднодиссоциирующую. Кофермент легко присоединяется к различным апоферментам, а простетическая группа соединяется только с одним и тем же апоферментом.

Функции и свойства апофермента и кофактора следующие. Апофермент термолабилен, определяет специфичность фермента, участвует в соединении фермента с субстратом [S], активирует кофактор. Кофактор термостабилен, стабилизирует апофермент, участвует в катализе.

В роли кофактора могут выступать ионы металлов (Na⁺, К⁺, Mg⁺², Са⁺², Fe⁺²) и микроэлементы (Mn²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и др.). Коферменты часто бывают представлены веществами органической природы — нуклеотидами, витаминами и др.

Согласно современным представлениям, ферменты увеличивают скорость химических реакций, снижая энергетический барьер данной реакции. Это положение лежит в основе теории Михаэлиса—Ментен — теории образования фермент—субстратного комплекса. По этой теории ферментативное действие зависит от скорости образования комплекса фермента с субстратом и скорости последующего распада этого комплекса с образованием продукта реакции и освобождением фермента.

Для каждого фермента можно определить константу Михаэлиса (Km):

где Кm — константа Михаэлиса, [S] – концентрация субстрата, V mах — максимальная скорость реакции (при насыщении фермента субстратом), V — скорость реакции в условиях опыта.

По величине Кm можно судить о скорости ферментативной реакции: чем ниже числовое значение Кm, тем выше активность фермента (тем легче образуется фермент — субстратный комплекс и продукты реакции).

Характерные свойства ферментов:

- чувствительность к изменению реакции среды, зависимость активности фермента от величины рН;

- специфичность действия;

- термолабильность и температурный оптимум действия ферментов;

- влияние на активность ферментов различных веществ — активаторов и ингибиторов.

Практическая часть.

1. Влияние реакции среды на активность амилазы.

Принцип метода. Каталитическая активность ферментов зависит от рН среды. С изменением величины рН меняется структура фермента. Для каждого фермента характерен определенный оптимум рН. От рН зависит степень ионизации фермента.

З ависимость ферментативной активности от рН среды изучается в работе на примере α— амилазы, субстратом которой является крахмал (полисахарид, состоящий из глюкозы). Фермент α- амилаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза) содержится в слюне и катализирует гидролиз α- глюказидной связи α-1,4-крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Кроме того, в слюне имеется Фермент мальтаза, расщепляющая мальтозу до глюкозы.

крахмал декстрины мальтоза

Гидролиз крахмала под действием α- амилазы проходит до стадии образования декстринов. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, декстрины в зависимости от размера дают с йодом окрашивание: амилодекстрины — фиолетовое, эритродекстрины — красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза — желтое (цвет йода в воде, т.е. окрашивание с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно—восстановительная реакция. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь — гидрат окиси меди (голубого цвета) восстанавливается в гидрат закиси меди желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди.

Реактивы: амилаза слюны (прополаскивают рот, затем набирают 10—15 мл дистиллированной воды и держат ее во рту в течение минуты, после чего сливают в стаканчик); крахмал, 0,1 % раствор на 0,3 % растворе хлорида натрия; раствор Люголя; едкий натр, 0,1 Н раствор; HCl, 0,1 Н раствор.

Ход работы: Активность амилазы слюны неодинакова у разных людей и даже меняется в течение дня у одного и того же человека. Поэтому необходимо подобрать подходящее разведение раствора слюны так, чтобы гидролиз 1 мл раствора крахмала при комнатной температуре и нейтральной реакции среды под влиянием 1 мл раствора слюны проходил на 5—8 минут. Для этого в пробирке смешивают 1 мл раствора крахмала и 1 мл раствора слюны. Сразу же после смешивания каплю смеси помешают в чистую пробирку, добавляют каплю раствора Люголя и отмечают окраску. В дальнейшем пробы берут с интервалом в полминуты. Реакция считается законченной, когда цвет раствора Люголя не изменяется. Если гидролиз крахмала происходит быстро, то слюну разводят и снова определяют время расщепления крахмала. Если гидролиз крахмала идет медленнее, чем 10 минут, то к раствору фермента добавляют несколько капель неразведенной слюны и определяют время полного гидролиза крахмала. После подбора нужной активности фермента выполняют основную часть работы по изучению влияния реакции среды на активность амилазы.

Схему построения опыта и получение результатов записывают в таблицу:

пробы	НС1 0,1н; мл	NaOH 0,1н; мл	H2O мл	рН	Крахмал мл	Фермент мл	реакция с йодом
1	0,5	-	1,5	Кислая	2	1
2	-	-	2,0	Нейтральная 6,9-7,0	2	1
3	-	0,5	1,5	Щелочная	2	1

Так как оптимум рН для амилазы слюны равен 6,9 –7,0, наблюдение за гидролизом крахмала ведут по пробе № 2 и добавляют раствор Люголя. Как только гидролиз во второй пробе закончится, опыт прекращают добавлением во все три пробы 2-3 капли раствора Люголя.

Пробу № 3 перед добавлением раствора Люголя нейтрализуют 0,1н раствором соляной кислоты, так как в щелочной среде реакция с йодом не идет.

Наблюдают отсутствие реакции с йодом во второй пробе и фиксируют оттенок в первой и третьей пробах. Результаты записывают в таблицу, делают выводы о влиянии реакции среды на активность амилазы.