13. Химико-токсикологический анализ в диагностики острых отравлений.

Иногда отождествляют понятие «токсикологическая химия» и «Химико-токсикологический анализ». Токсикологическая химия- это наука, которая разрабатывает новые и совершенствует уже существующие методы определения ядовитых веществ в различных объектах, дает теоретическое обоснование этих методов. Химико-токсикологический анализ представляет собой совокупность научно обоснованных методов, применяемых на практике для выделения, обнаружения и количественного определения токсических веществ. Химико-токсикологический анализ проводится с целью судебного анализа в случае отравления, с целью убийства (самоубийства) или для установления причин отравлений в клинике или лаборатории.

Основной задачей химико-токсил. анализа является установление

природы яда (общие исследования на неизвестный яд или частное исследование на

идентифицированный яд).

Этапы химико-токсил. анализа.

1. Выбор объекта исследования

2. Определение количества расходуемого объекта.

3. Выбор метода изолирования

4. Очистка яда от эндогенных соединений

5. Проведение идентификации и количественного определения.

6.Оценка результатов проведенного анализа

Особенности химико-токсил. анализа.

1. Характеристика объекта исследования

2. Разнообразие ядов, встречаемых при отравлениях по мере поступления в организм и

нахождения в нем.

3. Значительные изменения объекта во времени

4. Изменение токсического вещества в объекте

5. Близость структуры яда и эндогенного соединения

6.Разнообразие объектов исследования :органы трупов, моча и кровь трупов, рвотные массы, экскременты, волосы, ногти, промывные воды желудка, остатки пищи, напитки, пестициды, части растений, обработанные пестицидами, вода водоемов, пробы воздуха промышленных предприятий, почва, предметы домашнего обихода, одежда и др.

Химико-токсикологический анализ характеризуется разнообразием объектов исследования, содержащих незначительные количества токсических веществ. Эти вещества являются микрокомпонентами в большом количестве биол. м-ла. Прежде чем приступить к обнаружению и количественному определению токсических веществ, необходимо выделить их из соответствующих объектов. Выбор методов выделения токсических веществ зависит от характера объекта исследования. При использовании неподходящего метода выделения токсического вещества из исследуемого объекта оно может быть частично или полностью потеряно в ходе химико-токсил. анализа. Причем в ряде случаев для выделения одного и того же вещества из различных объектов необходимо применять разные методы.

Одной из особенностей химико-токсил. анализа является и то, что наряду с исследованием веществ, вызвавших отравление, необходимо выделять из биол. м-ла и определять их метаболиты.

14. Острая алкогольная интоксикация.

Эта патология обусловлена приемом этанола или различных алкогольных напитков с содержанием этанола более 12%. При поступлении в организм этанол претерпевает две четко выраженные фазы распределения: резорбциии (всасывание) и элиминации (выделение). Легко проникая через тканевые мембраны, алкоголь быстро всасывается в желудке: около 20% и в тонком кишечнике - около 80%. В среднем через 1,5 часа после поступления этанола в организм, его концентрация в крови достигает максимального уровня. Конц. спиртовые напитки с концентрацией этанола более 30%, всасываются быстрее. Пищевые массы в желудке замедляют всасывание вследствие своих адсорбционных свойств. При приеме алкоголя натощак, при повторных приемах, а также у людей с заболеваниями желудка (гастрит, язва), скорость всасывания значительно выше. 90% поступающего в организм алкоголя подвергается окислению в печени. Скорость окисления -6-7 г/ч. В окислении принимает участие алкогольдегидрогеназа. В обычных условиях незначительная часть этанола (1 - 2%) окисляется до ацетальдегида ферментом каталазой, которая находится во всех тканях организма. Около 10% всосавшегося этанола выделяется в неизменном виде через легкие и с мочой в течении 7-12 часов. Этанол обладает психотропным действием, связанным с наркотическим эффектом на ЦНС. Наркотический эффект зависит от фазы интоксикации. Так, в фазе резорбции эффект больше, чем в фазе элиминации, несмотря на то, что концентрация этанола в крови в обеих фазах будет одинаковой. Наркотический эффект также зависит от концентрации этанола в крови, от степени развития толерантности больного к алкоголю. Смертельная доза этанола при однократном приеме составляет 4 - 12 г на 1 кг веса тела. В среднем это 300 мл 96% спирта при отсутствии толерантности. Алкогольная кома развивается при концентрации алкоголя в крови около 3 г/л, а смертельная концентрация - 5 - 6 г/л. В течении острого алкогольного отравления можно выделить следующие характерные патологические синдромы. В токсикогенном периоде это: коматозное состояние, невралгические расстройства, нарушение дыхания, нарушение функций сердечно-сосудистой системы (ССС). В соматогенный период проявляются психоневрологические расстройства, воспалительные поражения органов дыхания.

В токсикогенный период тяжесть состояния больного определяется глубиной комы и сопутствующими осложнениями. Существует 2 стадии алкогольной комы: 1) поверхностная и 2) глубокая кома. Стадия поверхностной комы характеризуется потерей сознания, снижением зрачковых рефлексов, резким угнетением болевой чувствительности и отсутствием контакта. Стадия глубокой комы выражается утратой болевой чувствительности, отсутствием или резким снижением зрачковых и сухожильных рефлексов, мышечной атонии и снижением температуры тела. Диагностика алкогольной комы основывается на :

1. клинической картине отравления;

2. данных ЭЭГ;

3. лабораторных данных;

Наибольшие трудности представляет дифференцированная диагностика алкогольной комы от коматозных состояний, вызванных следующей патологией, сочетающейся с алкогольным опьянением: черепно-мозговая травма, острое нарушение мозгового кровообращения, отравление ложными суррогатами алкоголя, галогенпроизводными, метанолом, этиленгликолем, снотворными препаратами и транквилизаторами, а также диабетическая кома.

15-16.Острые отравления лекарственными препаратами. Экпресс-методы.

Как и в случае любых химических токсикантов, специфическое ток¬сическое действие лекарственных веществ проявляется на ранней стадии острых отравлений — в токсикогенном периоде. Неспецифиче¬ское действие характерно для соматогенного периода. Специфическое действие токсиканта приводит к многочисленным патологическим про¬цессам, поэтому важно определить природу лекарственного вещества в начале токсикогенного периода.В настоящем разделе рассматриваются результаты химико-токсил. исследования лекарственных средств, отравления которы¬ми происходят наиболее часто.

Отравления барбитуратами

Производные барбитуровой кислоты оказывают тормозящее действие на ЦНС. Лекарственные средства этой группы используют в качестве ус¬покоительных, снотворных, противосудорожных и средств для наркоза. Барбитураты быстро всасываются из желудочно-кишечного тракта. Для скринингового определения барбитуратов используют иммуно-химические методы (ИФА, РИА, ПФИА). При определении барбитуратов методом ТСХ их экстрагируют из биожидкости, которую предварительно подкисляют. В качестве экстрагентов применяют различные растворители, а также двух- и трехкомпонентные смеси: бензол-этилацетат (2:1), хлороформ-изопропанол-аммиак (5:5:1) И качестве реагентов для проявления используют сернокислый раствор сульфата ртути и дифенилкарбазон. Сине-фиолетовое окрашивание пятен, совпадающих по Rf со стандартами определяемых веществ, позволяет сделать вывод о присутствии барбитуратов в анализируе¬мой пробе. Количественное определение производных барбитуровой кислоты можно проводить спектрофотометрически в ультрафиолетовой области по полосе поглощения с ^тах = 260 нм, измеряя разность абсорбции щелочного раствора барбитурата (тетраборатный буфер) при рН среды 10,0 и 13,0.Производные барбитуровой кислоты определяют также методом ГЖХ с использованием полярных и неполярных жидких фаз. Опреде¬ление осложняется адсорбцией барбитуратов на твердых носителях. Для подготовки пробы в образец вводят 0,25 М серную кислоту и очи¬щенный хлороформ. Проводят экстракцию и центрифугируют (8000 об/мин). Для анализа отбирают 1—5 мкл хлороформного извлечения. Используют ступенчатые температурные режимы колонки, например 180, 200 °С для барбитала, барбамила, нембутала и 230 °С для фено-барбитала.

Отравления лекарственными средствами группы бензодиазепинов

Лекарственные средства группы бензодиазепинов например хлордиазепоксид (хлозепид), медазепам, диазепам (сибазон), оксазепам, нитразепам, феназепам, алпрозолам — высокоактивные транквилизаторы с относительно малой токсичностью. Эта группа лекарственных средств ежегодно пополняется вновь синтезиро¬ванными соединениями с раз-личными заместителями. Относительная доступность бензодиазепинов приводит к злоупот-реблениям и передозировкам.Производные бензодиазепина легко всасываются из желудочно-ки¬шечного тракта, максимальное количество в крови обнаруживается че¬рез 1—3 ч. Степень связывания с белками плазмы высокая (например для диазепама степень связывания достигает 98%). Производные бензо¬диазепина как липофильные вещества депонируются в жировой ткани с последующим постепенным высвобождением в кровь. По этой причи¬не бензодиазепины имеют довольно большой период полувыведения, например, для диазепама он составляет около 98 ч. Экскреция веществ этой группы — почечная (более 60% дозы) и кишечная.Экспресс-анализ бензодиазепинов проводят имунными методами (ИФА, РИА, ПФИА), оценивая общее содержание этих соединении.Определение бензодиазепинов проводят или по продуктам гидролиза — бензофенонам, или по исходным веществам и их метаболитам. Для проведения гидролиза анализируемую пробу биожидкости помещпнп и 6 М НС1 и нагревают при 140 °С в течение 60 мин. Экстракцию образующихся в процессе гидролиза аминобензофенонов проводят гептаном при рН 6,0—8,0. Анализ экстрактов проводят хроматографическими методами.При определении бензодиазепинов методом ТСХ в качестве подвиж¬ной фазы используют бензол. Обнаружение после разделения проводят по собственной желтой окраске с флюоресценцией в ультрафиолетовом свете. Предел обнаружения составляет 1—5 мкг в пятне. Элюаты хрома-тограмм используют для снятия электронного спектра или газохромато-графического исследования. Основные полосы поглощения аминобензо¬фенонов в этаноле 230—240 и 390—400 нм. Количественное определение можно проводить фотоколориметрическим методом по окрашенным продуктам реакции бензофенона с образованием азокрасителя.Анализ биологической пробы без предварительного гидролиза поз¬воляет обнаружить индивидуальные вещества и их метаболиты. Для этого проводят экстракцию бензодиазепинов из биообъектов органиче¬скими растворителями при рН 6,0—8,0 и последующее хроматографи-ческое определение.Для определения методом ТСХ применяют системы хлороформ-метанол (9:1), этилацетат—метанол—аммиак (85:10:5). Используя элю¬аты с ТСХ-пластин, проводят определение методом ГХ-МС по нативным соединениям или их летучим производным (дериватам).Возможно ВЭЖХ-определение производных бензодиазепина по нативным веществам или продуктам гидролиза. В качестве подвижной фазы можно использовать смесь ацетонитрил—0,05 М водный двузамещенный фосфат аммония (35:65 для нативных соединений или 55:45 для бензофенонов). Детектирование в ультрафиолетовых лучах прово-дят при 230—220 нм.

Отравление лекарственными средствами группы фенотиазинов

Лекарственные средства группы фенотиазина используются как транквилизаторы, антидепрессанты, антигистаминные и антиангинальные средства. Из алкильных производных фенотиазина наиболее известны аминазин (хлорпромазин), пропазин (промазин), левомепразин (тизерцин), метеразин (прохлорперазин), тиоридазин, хлорпротиксен, трифтазин.Из ацильных производных фенотиазина широко применяются этацизин, этмозин, нонахлазин и др.Производные фенотиазина химически очень лабильны и в орга¬низме подвергаются биотрансформации. Для экспресс-определения фенотиазинов в моче используют реак¬цию с FNP-реактивом, который состоит из смеси водного раствора хлорида железа (III), хлорной кислоты (НСЮ4) и азотной кислоты (1:9:10). Появляющаяся окраска от розовой до сине-фиолетовой свидетельствует о присутствии фенотиазинов или их метаболитов. Вслед¬ствие недостаточной специфичности реакции возможно получение ложноположительных результатов. Определению мешают салицилаты, желчные пигменты и другие соэкстрактивные вещества биологической пробы.Дальнейшее определение проводят методами ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ. При подготовке проб мочи и крови для ана¬лиза проводят гидролиз. Затем экстрагируют фенотиазины смесью гептан—3% изопентанол. Для ТСХ используют системы бензол— диоксан—25% аммиак (60:35:5) и этилацетат—ацетон—25% аммиак в этаноле 1:1 (50:45:4). Применяют также системы толуол—ацетон-этанол—25% аммиак (45:45:7,5:2,5) и диоксан—хлороформ—аце¬тон—25% аммиак (47,5:45:5:2,5). Детектирование проводят спирто¬вым раствором конц. серной кислоты (9:1) или реактивом Марки (H2SO4 + СН2О). Все фенотиазины дают красное или темно-красное окрашивание, кроме левомепразина, имеюще¬го голубую окраску. Количественное определение проводят фото¬метрическим методом по окрашенному продукту взаимодействия производного фенотиазина с метиленовым оранжевым или кисло¬тами.Для определения фенотиазинов методом ГЖХ используют тот же экстракт, температура колонки 230 °С или программирование от 130 до 290 °С со скоростью 20 °С/мин при температуре испарителя 250 °С.Для определения фенотиазинов используют ГХ-МС элюатов с ТСХ-пластин по нативным соединениям или ацето- и фторзамещенным де¬риватам.Возможно ВЭЖХ-определение производных фенотиазина в моче и сыворотке крови с использованием автоматических анализаторов; пре¬дел обнаружения 0,1 мкг/мл.

Отравление лекарственными средствами группы трициклических антидепрессантов

К группе трициклических антидепрессантов относятся амитриптилин, имизин, соответствующие N-дезметильные аналоги нортриптилин и дезипрамин. В анализе химико-токсикологические лаборатории вы¬полняют качественное обнаружение амитриптилина в моче методом ТСХ. При скрининговых исследованиях проводят экстракцию из мочи хлороформом или эфиром при рН 10,5—11,0. Упаренный экстракт на¬носят на пластинку и проводят хроматографирование в различных сис¬темах, например этилацетат—ацетон—раствор аммиака в этаноле (50:45:5), бензол—диоксан—аммиак (60:35:5). Проявление проводят оп¬рыскиванием конц. серной кислотой; наблюдается оран¬жево-кирпичная окраска. Предел обнаружения составляет 0,1 мкг в пятне.Количественное определение амитриптилина и нортриптилина про¬водят экстракционно-фотометрическим методом по комплексу с бром-феноловым синим после экстракционной и хроматографической очи¬стки. Предел обнаружения составляет 1 мкг/мл (в случае смертельных отравлений). Для экспресс-диагностики антидепрессантов в крови и моче ис¬пользуют также иммунохимические методы, например ПФИА. При этом удается снизить предел обнаружения на порядок — до 0,01 мкг/мл. Таким образом, иммунохимический метод позволяет выявить передо¬зировку лекарственного средства, что особенно важно в связи с малой широтой терапевтического интервала (близость терапевтических и ток¬сических доз).Для дифференциальной диагностики, изучения фармако- и токсикокинетики используют методы ГЖХ и ВЭЖХ (предел обнаружения 1 мкг/мл). При определении токсических концентраций в крови для снижения предела обнаружения (до 0,2 мкг/мл) проводят предвари¬тельное превращение в трифторацетатные производные.

Отравление антигистаминными лекарственными средствами

К антигистаминным средствам относятся вещества, блокирующие Н-гистаминовые рецепторы. Это представители разных химических классов органических веществ (например, димедрол, супрастин, тавегил, диазолин), что объясняет применение различных методик для их определения. Дифенилгидрамин довольно легко всасывается после приема внутрь (биодоступность 50%). Связывание с белками плазмы достига¬ет 72—98%, период полувыведения из крови 3—10 ч. Основные пути метаболизма - N-дезалкилирование, окислительное дезаминирование, конъюгация. Лишь 2-4% дозы выводится в неизмененном виде с мочой.Анализ на дифенилгидрамин проводится после экстракции веществ основного характера. Определение методом ТСХ проводят в общих си¬стемах, например бензол—диоксан—аммиак (60:35:5); проявляют оп¬рыскиванием конц. серной кислотой - образуется лимонно-желтое окрашивание.Для ГЖХ-анализа используют тот же экстракт; температура колонки 230 °С или программирование от 130 до 290 °С со скоростью 20 °С/мин, температура испарителя 250 °С.

Отравление лекарственными средствами группы сердечных гликозидов

К группе сердечных гликозидов относятся дигитоксин и другие кардиотоксичные гликозиды, которые содержатся, например, в наперстян¬ке. Их применяют как антиаритмические средства. Из структуры дигоксина следует, что гликозиды имеют высокую молярную массу, химически неустойчивы. Их терапевтические и токсические концент¬рации очень низкие, в связи с чем определение этих веществ, особенно в биологических м-лах, представляет определенные трудности. Доля связывания с бел¬ками 20-40%, доля выведения с мочой 60-90%, период полувыведения из плазмы 4—100 ч. Методы ВЭЖХ, ТСХ можно применять для определения сердечных гликозидов в сырье или в вещественных доказательствах, но не в биоло¬гических жидкостях, где их концентрация очень мала. Для определения гликозидов в моче используют иммунохимические методы.