Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

ФХМА (sol2019) / Учебная литература / Методички / Туркельтауб - Часть 2, Жидкостная хроматография

.pdf
Скачиваний:
143
Добавлен:
15.04.2019
Размер:
3.4 Mб
Скачать

48

объемов могут быть очень большими и

ограничиваются лишь практическими возможностями,

связанными с ограниченной чувствительностью

детектора, а также с ограниченными временем и денежными затратами на проведение разделения. В связи с этим в ГПХ приходится уделять большое внимание качеству насадки, а также эффективности и конструкции всей хроматографической системы; необходимо, кроме того, чтобы значения рабочих

параметров процесса разделения были близки к

оптимальным.

Максимальное число компонентов (mmах),

которые можно разделить на колонке для ГПХ с

учетом ограниченного рабочего диапазона удерживаемого объема определяется:

mmах 1+0.2N½. (39)

где N—число теоретических тарелок для данной колонки. Из общей теории хроматографии следует, что наибольшую степень разделения в ГПХ должны

обеспечивать длинные и узкие колонки с

мелкозернистыми насадками. С учетом этого чаще

всего применяют жесткие и полужесткие сорбенты. Полужесткие сорбенты изготавливают на основе

органических сополимеров. Для работы с органическими подвижными фазами обычно используют стиролдивинилбензольные гели (например, стирогель), для работы с водными

подвижными фазами применяют полярные сополимеры (например, оксиэтилметилметакрилат с этилендиметакрилатом). Эти гели адсорбционно

значительно менее активны чем жесткие. Они предпочтительны для анализа биополимеров.

Недостаток – невысокое значение предельного давления. Жесткие гели на основе силикагелей

 

21

 

 

 

анализируемого вещества (сорбата); EVi

энергия

когезии

анализируемого

вещества;

R

универсальная газовая постоянная; T – температура; VS/Vm —соотношение объемов неподвижной и подвижной фаз.

Время анализа принято считать оптимальным,

если компоненты анализируемой смеси элюируют из

колонки при значении k в пределах от 2 до 10. Это уравнение можно переписать в виде:

lnki = ( i /RT)[lnVS/Vm +{( m+ s-2 i)( m- s)}]

Если каждую из круглых скобок приравнять нулю,

то получим:

 

 

Bариант А: ( m- s) 0

m= s

Bариант Б:

( m+ s-2 i 0 i =( m- s) /2.

Можно

выбрать

подвижную и неподвижную

фазы (первый вариант) примерно одинаковой полярности (т. е. m s). Если при этом наблюдается

желаемое воздействие на удерживание, полярность

исследуемых образцов не играет никакой роли, и, следовательно, такой подход приводит к получению

весьма неселективной фазовой системы.

Во втором варианте полярность образца примерно равна половине суммы полярностей подвижной и неподвижной фаз:

i ( m+ s)/2

На рисунке 32 показаны три горизонтальные оси (сверху вниз), на которых приведены параметры

растворимости неподвижной фазы ( s), анализируемого образца ( i) и подвижной фазы ( m).

http://www.mitht.ru/e-library

22

Рисунок 32. Выбор фазовых систем для

жидкостной хроматографии.

На рисунке изображены две линии,

иллюстрирующие два примера выбора возможных фазовых систем для элюирования образца с i=12. Нормально-фазовой (НФЖХ) системе отвечает линия

1 с положительным тангенсом угла наклона,

соединяющая точку m = 7 (н-гексан - подвижная фаза малой полярности) с точкой m = 16 (силикагель - полярная неподвижная фаза).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) (распределительная хроматография)

соответствует линии 2, которая соединяет точку m = 7 (типичная неполярную неподвижная фаза) с точкойm = 16 (полярная подвижная фаза). Такую

подвижную фазу можно, например, получить, смешав метанол ( m 15) с водой ( m 25) в нужной пропорции.

Наличие столь высокой полярности воды делает обращенно-фазовую систему очень гибкой, так как

эта система может перекрыть смешанными фазами (из метанола и воды или даже из тетрагидрофурана

47

скорость элюирования компонента определяется

равновесным распределением его между двумя

фазами. В эксклюзионной хроматографии можно

считать, что распределение происходит между двумя фазами, где в качестве неподвижной фазы рассматривается тот же растворитель, находящийся в порах сорбента.

Рисунок 42. Схематическое изображение зависимости молекулярной массы от удерживаемого объема для эксклюзионной хроматографии.

То, что величина Kd удовлетворяет неравенству 0 Kd l, накладывает существенные ограничения на

разделительную способность метода. Полный

рабочий диапазон объемов удерживания в ГПХ

ограничен интервалом (0,4 — 0,9) VС где VС—полный объем (незаполненной) колонки. (Примерно 0,1 VС занимает объем твердой матрицы сорбента без пор.)

Этим ГПХ резко отличается от других типов хроматографии, в которых величины удерживаемых

http://www.mitht.ru/e-library

46

концентраций вещества в неподвижной и подвижной

фазах. Тогда объем удерживания будет равен

VR = Vm + KdVs .

VR—удерживаемый объем данного компонента пробы, характеризующегося определенным значением объемного коэффициента распределения Kd, который является мерой кажущегося проникновения данного компонента в поры частиц наcадки, Vm = Vo.

Если не происходит никакого взаимодействия

(адсорбции) между компонентами пробы и поверхностью частиц насадки, то значения коэффициента распределения Kd заключены в интервале между 0 и 1. Для конкретной системы полимер — растворитель в данной колонке

существует

определенное соотношение между

размером

молекул (молекулярной массой)

и

удерживаемым объемом; по данным удерживания для узких фракций (по молекулярной массе),

молекулярные массы которых были определены каким-либо независимым методом, можно построить калибровочный график для данной колонки (обычно график зависимости lgM от VR). Схематическое

изображение калибровочной кривой, типичной для

эксклюзионной хроматографической колонки,

показано на рис. 42.

Из рисунка видно, что в области Vm и Vt график имеет явно нелинейных характер. Поэтому всегда

нужно стремиться выбирать колонку (или набор колонок) так, чтобы разделение анализируемого полимера протекало в пределах линейного участка

калибровочной кривой.

Как отмечалось в самом начале нашего рассмотрения процесса хроматографии (рис.1),

23

( m 10) и воды) очень широкий диапазон полярности

подвижной фазы. Не меняя колонку с неподвижной

фазой можно достигнуть элюирования различных анализируемых веществ. Фактор удерживания можно сдвинуть в оптимальный диапазон, выбрав подвижную фазу, еще чуть сильнее или слабее

(таблица 12). Таким образом, уравнение зависимости

фактора удерживания от параметров растворимости в подвижной и неподвижной фазах может служить

хорошим (хотя и качественным) показателем

поведения систем, используемых в жидкостной хроматографии.

Использование параметра растворимости дает лишь приближенную оценку элюирующей силы растворителей, используемых в качестве подвижной фазы. Другую более точную оценку предложил для

распределительной хроматографии Л. Снайдер. Он

ввел параметр полярности Р для распределительной хроматографии, который позволил количественно

оценить полярность большинства растворителей

(табл.12).

В основе классификации полярности подвижной фазы в хроматографии жидкость-жидкость лежат

экспериментально найденные значения констант распределения в хроматографии газ-жидкость. Для этанола (e), 1,4-диоксана (d) и нитрометана (n), а

также н-октана ( ) определены константы

распределения для большого количества неподвижных фаз:

P = lg Ke’’ + lg Kd’’ + lg Kn’’ , (29)

При этом первый член (этанол; lg Ke’’) отражает

вклад донора протонов, второй член (1,4-диоксан; lg Kd’’) отражает вклад акцептора протонов, третий член

(нитрометан; lg Kn’’) отражает вклад “сильного

http://www.mitht.ru/e-library

24

дипольного взаимодействия”.

Значение фактора удерживания в зависимости от параметра полярности Р можно найти, используя

уравнение (30):

 

 

 

lg(k2/k1) = (P1 – P2)/2.

 

(30)

Чтобы получить оптимальное значение фактора

удерживания

пользуются

обычно

смесью

растворителей. Полярность смесей растворителей можно рассчитать по формуле

Рij = Рi Ni j Nj,

 

 

 

(31)

где

Рi,

 

Рj

-

параметры

полярности

соответствующего растворителя; Ni, Nj

- объемная

доля компонента I,j соответственно.

 

Таблица 12.

Параметры растворителей для

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Растворитель

Параметр

Пара-

Элюи-

Вязкость,

 

 

 

раствори-

метр Р

рую-

МПа c

 

 

 

мости

 

 

щая

 

 

 

 

 

 

 

сила

 

 

 

 

 

 

 

o

 

Ацетонитрил

 

13.1-11.2

5.8

0.51

0.34

 

 

 

 

 

 

 

 

Бензол

 

 

 

9.2

2.7

0.25

0.60

 

 

 

 

 

 

 

Вода

 

 

25.5-21.0

10.2

1.50

0.89

 

 

 

 

 

 

*

 

Гексан

 

 

 

7.3

0.01

0.01

0.30

 

 

 

 

 

 

 

Диметилфор-

 

 

11.5

6.4

1.00

0.80

мамид

 

 

 

 

 

 

 

Диоксан

 

 

10.6-9.8

4.8

0.50

1.20

 

 

 

 

 

 

 

Дихлорэтан

 

 

9.7

3.5

0.20

0.78

 

 

 

 

 

 

 

 

45

на колонках для жидкостной хроматографии. Это

объясняется тем, что разность удельных энергий

адсорбции (растворения) становится слишком мала

для разделения соседних полимергомологов. Поэтому для высокомолекулярных соединений

используются эксклюзионная (молекулярно-ситовая или гель-проникающая) хроматография. Сегодня она использует силикагели с заданным объемом пор. Удерживание молекул в эксклюзионной колонке

зависит от соотношения размеров молекул и пор.

Самые малые молекулы проникают во все поры, поэтому их время удерживание наибольшее.

Молекулы, размер которых больше элюируют позже

самых больших, но раньше самых малых молекул. Полный объем растворителя в колонке складывается из суммарного объема всех имеющихся пор Vi и полного объема пустот между частицами насадки Vo

Vt = Vo + Vi ,

Самые большие молекулы анализируемых

веществ совсем не задерживаются насадкой и элюируются из колонки с удерживаемым объемом Vo . Малые молекулы способны проникать во все поры

частиц насадки и элюируются из колонки с удерживаемым объемом Vt . Определенная доля

объема пор доступна компонентам анализируемой

пробы с молекулами промежуточных размеров, и эти компоненты элюируются из колонки с удерживаемыми объемами в интервале между Vo и Vt. Таким образом, удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры, что зависит от соотношения

размеров молекул и пор.

Константа распределения Kd, как и в других вариантах хроматографии, определяется отношением

http://www.mitht.ru/e-library

44

Рисунок 41. Разделение 6 рацемических кислот (обозначены на хроматограмме) на колонке 100х4,2мм с LiChrosorb RP-18, модифицированной адсобцией N– гексадецил-L-гидроксипролина. Подвижная фаза:метанол/вода 15/85, рН 5,0, 0,0001 М Cu(AcO)2.

Скорость потока 2 мл/мин.

На рис.41 приведена хроматограмма разделения

смеси 6 рацемических кислот на одной из таких колонок. Метод хиральной лигандообменной

хроматографии внес значительный вклад в развитие

химии природных соединений, а через нее в фармацевтическую науку и промышленность.

6.5. Ситовая ксклюзионная) хроматография

По мере увеличения молекулярной массы

отдельные полимергомологи перестают разделяться

25

Изооктан

7.0

0.01

0.01

0.47

 

 

 

 

 

Метанол

15.8-12.9

5.1

0.72

0.54

 

 

 

 

 

Метилэтилке-

 

4.7

0.40

0.38

тон

 

 

 

 

Изопропанол

12.4

3.9

0.60

1.90

 

 

 

 

 

Тетрагидро-

9.9

4.0

0.53

0.46

фуран

 

 

 

 

Хлороформ

9.1

4.1

0.26

0.53

 

 

 

 

 

Этилацетат

8.6

4.4

0.40

0.43

 

 

 

 

 

Однако необходимо учитывать смешиваемость

растворителей. На рис. 33 показано, что около 65% (17 из 26) приведенных растворителей не

смешиваются с водой.

http://www.mitht.ru/e-library

26

Рисунок 33. Диаграмма смешиваемости растворителей.

Для химически модифицированного кремнезема существует адсорбированный слой компонентов

подвижной фазы, не обязательно идентичный подвижной фазе по составу. Для привитых фаз, таких

как С18, менее полярный компонент смачивает поверхность. Для полного смачивания необходимо

минимальное критическое содержание органических веществ (2% по объему). Если привитую фазу не смочить, она сжимается, «опадает на поверхность» и вызывает резкое уменьшение числа доступных центров взаимодействия.

43

6.4. Лигандообменная хроматография.

Метод лигандообменной хроматографии был

предложен в 1961 году Ф.Гельферихом, который

использовал колонку с ионообменником, насыщенную аммиакатом меди для выделения диамина. Метод основан на способности ионакомплексообразователя, находящегося в неподвижной фазе, обменивать координированные им лиганды на другие, которые доставляются

подвижной фазой. Открытие В.А.Даванковым и

Е.Гиль-Авом хиральной лигандообменной хроматографии в 1966-1968 г. явилось прорывом в

области энантиоселективных технологий. Сорбент

для жидкостной хроматографии в 1968 году был получен введением в структуру сшитого полистирола остатков оптически активной -аминокислоты L-

пролина. На колонке 140 мм с диаметром зерен

сорбента 50 мкм удалось полностью разделить энантиомеры практически всех аминокислот. На

сегодняшний день в литературе описано уже более

1300 хиральных неподвижных фаз. Кроме того,

обычную обращено-фазовую колонку ВЭЖХ можно превратить в хиральную лигандообменную путем

простой адсорбции L-оксипролина.

http://www.mitht.ru/e-library

42

уровне мкг/мл проводили на колонке Nucleosil SA 10,4х300 с градиентным элюированием 2-метилмолочной кислотой (pH 4,6). Концентрация катионов 10 мкг/мл. Скорость потока 1 мл/мин. Детектирование спектрофотометрическое

(600 нм).

На элюирующую силу подвижной фазы большое

влияние оказывают рН, природа буферного раствора,

ионная сила, содержание органического растворителя.

Ион-парная хроматография.

Ион-парная хроматография является еще одним вариантом ионообменной хроматографии. Она позволяет проводить определение ионогенных

веществ на колонках с химически модифицированным

силикагелем. При этом в подвижную

фазу

вводят небольшие

количества

(0,001-0.01М)

ион-парного реагента. В качестве ион-парных

реагентов используются додецилсульфат натрия, фосфат тетрабутиламмония и некоторые другие вещества. Эти вещества сорбируются за счет неспецифического взаимодействия с С18 на сорбенте и придают ему свойства ионообменника. В зависимости от природы ион-парного реагента сорбент приобретает свойства катионообменника или

анионообменника. Так, соли тетраалкиламмония (фосфат тетрабутиламмония) при рН 3 - 7 придают

сорбенту свойства анионообменника. Алкилсульфаты натрия при рН 2 - 5 придают сорбенту свойства

катионообменника.

Существует иная гипотеза, объясняющая разделение ионных соединений методом ион-парной хроматографии. По ней ион-парный реагент образует с анализируемым веществом ионную пару в подвижной фазе. Свойства этой пары и определяют времена удерживания разделяемых компонентов.

27

Распределение молекул анализируемого вещества

(сорбата) между неподвижной и подвижной фазами

определяется сравнительным сродством этих молекул к полярным и неполярным растворителям. Полярность сорбата зависит от наличия в структуре молекулы неионогенных и ионогенных полярных групп.

Для общей характеристики структурных

параметров анализируемых соединений В. Шатц

предложил упрощенный критерий гидрофобности Н. Данный критерий основан на двух допущениях: а)

что размер молекул сорбата определяется в первую

очередь числом атомов углерода; б) снижение гидрофобности при введении в молекулу сорбата полярной функциональной группы определяется не столько характером группы, сколько самим фактом ее наличия.

Суммарная гидрофобность соединения может быть рассчитана уравнением (32)

H = nh − 4 nf, (32)

где nh - число элементарных гидрофобных фрагментов

в молекуле, т. е. сумма атомов углерода и галогенов, а nf - число полярных групп.

Предполагается, что каждый атом галогена

эквивалентен метиленовой группе по своему влиянию

на гидрофобность вещества, Полярные группы, расположенные в непосредственном соседстве,

рассматриваются как одна полярная группа.

Критерий Н не позволяет дать детальное описание

гидрофобности в узких группах веществ, мало

отличающихся по структуре, а используется в качестве критерия гидрофобности для описания веществ, сильно отличающихся по строению.

http://www.mitht.ru/e-library

28

Критерий гидрофобности Н не учитывает

разветвленность, насыщенность, наличие циклов в

углеводородном радикале.

Рассчитаны значения Н для ряда известных органических соединений природного и синтетического происхождения. Критерий гидрофобности Н для этих органических соединений с молекулярной массой от 30 до 900 варьировался от –4.0 до 60-70.

Органические соединения с отрицательными

значениями Н= -4.0-0 отнесем к гидрофильным

соединениям. Они неограниченно или частично растворяются в воде, а значит для их анализа пригодны

водосодержащие ПФ. Сорбаты с Н=0-4.0 считают

низкогидрофобными. Эти соединения обычно хорошо растворяются в полярных растворителях и плохо в н- гексане. Производные углеводородов с различными функциональными группами, имеющие гидрофобность H от 4.0 до 20, растворяются в полярных и неполярных растворителях в зависимости от характера полярных

групп и их взаимного расположения. Трудно предсказать по величине Н их способность растворяться в тех или иных растворителях. При увеличении гидрофобности

понижается растворимость этих соединений в воде, но возрастает растворимость в неполярных растворителях.

Соединения с Н=20-60 практически не растворяются в

воде и часто не растворяются в н-гексане. При этом они хорошо растворяются в тетрагидрофуране и

хлороформе. Многие исследователи считают, что

растворимость образца в хлороформе и тетрагидрофуране входит в перечень важнейших критериев выбора варианта ВЭЖХ.

41

располагаются в следующем порядке

F Cl NO2 Br NO3 PO43 SO42 .

Рисунок 39. Хроматограмма анализа неорганических анионов с карбонатным элюентом.

Рисунок 40. Хроматограмма редкоземельных элементов. Определение редкоземельных металлов на

http://www.mitht.ru/e-library

34

фазы на ионы подвижной фазы.

Ионообменная хроматография - жидкостная

хроматография, в которой неподвижной фазой служит

катионит или анионит и разделение смеси ионизированных веществ происходит в результате различия в их константах ионного обмена, т.е. разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение

электронейтральности сорбента обеспечивается

наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к

поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя

с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство с фиксированными зарядами, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно

содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами. Амфотерные (биполярные) иониты содержат в своей матрице и

катионные и анионные обмениваемые группы.

Ионный обмен наблюдается при погружении в

раствор электролита ионообменника, который

поглощает из него катионы и анионы, выделяя в раствор эквивалентное число ионов того же знака.

Свойствами ионообменников обладает большое

число природных и синтетических соединений. Важнейшими из них являются синтетические полимерные смолы, полученные сополимеризацией

стирола и дивинилбензола. Любой ионообменник представляет собой матрицу, содержащую способные к обмену ионогенные группы (табл.13).

29

Рисунок 34. Условная

вероятность применимости

различных типов

хроматографических систем для

неионогенных сорбатов различной полярности: 1

-

сорбент — алкилсиликагель, подвижная фаза —

вода — метанол, вода — ацетонитрил; 2 — сорбент - силикагель, подвижная фаза — бинарные или более

сложные

смеси

органических

растворителей

различной

полярности;

3 — сорбент —

алкилсиликагель,

подвижная

фаза — метанол

либо ацетонитрил

с добавками

хлороформа либо

метиленхлорида.

 

 

Выбор условий разделения основываются на закономерностях, связывающих величины удерживания

со строением разделяемых веществ и составом фаз хроматографической системы. Так, введение в

молекулу органического соединения дополнительной метиленовой группы приводит к увеличению сродства

к неполярным средам. Следовательно, при этом возрастают коэффициенты емкости на алкилсиликагелях. При постоянных условиях

хроматографирования в гомологических рядах

наблюдается линейная зависимость k от числа атомов

http://www.mitht.ru/e-library

30

углерода. Удерживание в зависимости от условий

разделения возрастает в 1,3—2,2 раза на каждую

метиленовую группу. Введение в молекулы

сорбатов дополнительных полярных групп вызывает увеличение удерживания на силикагеле (в 2—6 раз на одну группу в зависимости от ее полярности и условий разделения) и уменьшение — на алкилсиликагелях

(в 1,5—3 раза).

Под термином «состав фаз хроматографической

системы» или «тип хроматографической системы»

понимают сочетание определенных признаков качественного состава: сорбента того или иного

химического класса, подвижной фазы на основе

водных или органических растворителей характеризующейся интервалом рН, наличием специфических добавок кислого, основного или поверхностно-активного характера и т. д. Выбор типа системы основывается в первую очередь на оценке полярности и кислотно-основных свойств компонентов

изучаемой смеси. Условная оценка полярности анализируемых веществ может быть основана на шкале упрощенного критерия гидрофобности Н.

При выборе хроматографической системы следует учитывать разный характер селективности

используемых сорбентов. Так, силикагель обычно

значительно более селективен при разделении изомеров. При разделении гомологов большей

селективностью обладают алкилсиликагели. Если в

анализируемой смеси предполагаются компоненты разной химической природы, то разработку условий лучше начать с алкилсиликагелей.

Схема применения различных типов хроматографических систем для ионогенных и неионогенных сорбатов различной полярности

39

при малых заполнениях колонки [E]= Q [X ] Q, а [Е]

≈СЕ .

Заполнение колонки не должно превышать 10%. Иными словами, количество определяемого иона должно быть как минимум в 10 раз меньше обменной

емкости сорбента.

В этом случае

 

K E X

DX

 

[E]

 

(34а)

Q

 

 

 

 

Согласно основному уравнению хроматографии (21) исправленный удерживаемый объем V’R равен

V’R = Dх Vs, где Vs — объем сорбента.

Отсюда, учитывая уравнение 1, {выражая Dx }

V '

 

 

KE

 

VS Q

(35)

 

CE

 

R

 

X

 

 

В ионной хроматографии удерживание иона на сорбенте чаще характеризуют величиной приведенного времени удерживания t'R {t'R = V’R/u},

которое равно

t '

 

 

K E

 

V S Q

 

 

 

u C E ,

 

 

R

 

X

 

(36)

где u — объемная скорость элюента. Объем

сорбента обычно определяют по его пористости ( ) и

общему объему колонки V:

Vs = (l - ) V. (37)

Тогда уравнение (36) принимает вид:

t'R

KE X

 

Q (1 ) V

,

(38)

 

 

 

 

u CE

 

Таким образом, время удерживания иона X при элюировании ионом Е прямо пропорционально коэффициенту селективности KE X , обменной емкости

Q и объему сорбента V. В то же время удерживание

http://www.mitht.ru/e-library