Оогенез

Этот процесс изучен немного лучше, чем сперматогенез. Во время развития ооцита он в тысячи и десятки тысяч раз увеличивается в объеме. При этом в ооците накапливается большой запас РНК, белков, органелл, питательных веществ, источников энергии и др., что является материнским вкладом в раннее развитие (у мышей этот запас направляет первый клеточный цикл, длящийся около 18-20 часов). Важным моментом является динамика экспрессии генов в ходе оогенеза. Сложность молекул РНК, содержащихся в ооцитах весьма велика. Так, в ооцитах Xenopus laevis она составляет 2x10⁷ нуклеотидов.

Больший вклад в сложность ооцитной РНК вносят два вида - гетерогенная ядерная РНК и мРНК. Общий синтез РНК в ооцитах в течение роста непрерывно увеличивается и снижается лишь при созревании яйца. В ооците обнаруживаются все основные виды РНК:

1. тРНК. Зрелый ооцит содержит в 60000 раз больше тРНК, чем соматические клетки. По отношению к другим видам РНК доля тРНК в конце развития ооцита снижается, тогда как на средних этапах вместе с 5S РНК она составляет около 90%.

2. рРНК. Эта РНК накапливается главным образом в конце развития ооцита и ее количество на этой стадии 200-300 раз больше, чем в соматических клетках.

3. гяРНК. Гетерогенная ядерная РНК, включающая в себя и пре-мРНК, синтезируется на стадииях, когда хромосомы приобретают структуру ламповых щеток. Одновременно с синтезом гяРНК идет и ее распад, поскольку она обладает маленьким временем жизни в клетке. ГяРНК определяет основную сложность РНК зрелого ооцита.

4. мРНК. При созревании ооцита в нем накапливаются так называемые материнские мРНК. Определенная часть их поступает в рибосомы и транслируется в ооците. Однако другая большая часть накапливается и хранится в ооплазме в форме РНП-информосом. В составе материнских мРНК имеются такие мРНК как гистоновые, актиновые, тубулиновые. Все они необходимы в больших количествах в период раннего развития организма.

В яйцах мышей находят довольно большое количество (около 1000) молекул мРНК, кодирующих онкобелки с цитоплазматической локализацией (c-raf-1, c-Ha-ras, c-Ki-ras, c-N-ras). В то же время мРНК для онкобелков с ядерной локализацией присутствуют в очень незначительных количествах. Так, мРНК гена c-myc материнского происхождения содержится в растущих ооцитах в количестве 1-10 копий на клетку (Pal et al., 1993). Лишь после оплодотворения число молекул этой мРНК резко возрастает, достигая к 4-х клеточной стадии 100-1000.

Материнские РНК элиминируют значительно (примерно на 50%) уже на 2-клеточной стадии. К стадии раннего бластоциста происходит почти полная замена материнских РНК на РНК, синтезированные в клетках зародыша. Это характерно, например, для материнской гистоновой мРНК.

Экспрессия генов в раннем эмбриогенезе

Зародыши по динамике синтеза РНК можно разделить на 2 группы: в мелких яйцах (млекопитающие) синтез РНК начинается почти сразу, а в крупных яйцах с большим запасом РНК (вьюн, шпорцевая лягушка) - на более поздних стадиях.

Долгое время считалось, что у млекопитающих транскрипция ДНК в 1-клеточных эмбрионах не происходит. Впервые об этом было сказано при анализе 1- и 2-клеточных зародышей мышей (Nature, 1982, 295, 342). Как показал дальнейший анализ у мышей активация зиготических генов может, по-видимому, происходить уже на 1-клеточной стадии в фазе G2. Экспрессия усиливается на 2-х клеточной стадии, когда синтезируются уже все основные виды РНК (Worrad et al., 1994).

В отличие от мыши у коров согласно последним данным активность эмбрионального генома наблюдается только около 8-клеточной стадии (Barnes, First, 1991), а у человека, по-видимому, между 4 и 8-клеточной стадиями (Braude et al., 1988).

В зиготе обнаружена экспрессия таких генов, как Sry, Zfy, Zfx, Sox-2, MHC classI, hsp70.1.

По мере созревания ооцита на 2-х клеточной стадии, тестируется, например, мРНК Siah-2. Аналогичный ген экспрессируется и в сперматоцитах (Della et al., 1995).

Появляются постепенно и мРНК для белков, выполняющих морфогенетическую функцию. Обращено внимание на 3 мРНК (ZP1-ZP3), кодируемые которыми гликопротеиды составляют значительную часть белков зоны пеллуцида. ZP1 экспрессируется в покоящихся ооцитах мыши, а две другие мРНК координированно накапливаются в ооцитах, начинающих расти и составляют в них около 1,5% всех мРНК (Epifano et al., 1995).

Важным моментом является не сама по себе транскрипция тех или иных геновв зиготе, а локализация соответствующих мРНК в ооците (Ding, Lipshitz, 1993). Для этой цели используются различные механизмы, в результате чего, например, в вегетальном полюсе ооцита Xenopus обнаруживают такие мРНК как мРНК фактора Vg1, TGFbeta-5 (это семейство TGF-beta), Xcat-2, Xcat-3 (РНК-связывающие белки). В анимальном полюсе концентрируются мРНК An1 - An3 (последняя также кодирует РНК-связывающий белок). Как показано экспериментально, первоначально мРНК Vg1 распределена равномерно по всему ооциту. Затем на стадии early IV мРНК начинается концентрироваться в вегетальной части и на стадии middle IV собирается в узкой зоне на вегитативном полюсе.

Интересные данные касающиеся роли регуляторных элементов структурных генов (энхансеров) были получены в более поздних экспериментах на 1- и 2-клеточных эмбрионах мышей (Majumder et al., 1993; Melin et al., 1993). С помощью микроинъекций рекомбинантных плазмид с различными промоторами и энхансерами и геном люциферазы в 1-и 2- клеточные эмбрионы эти авторы показали, что в 1-клеточных эмбрионах промоторы используются без энхансеров, а уже в 2-клеточных энхансеры требуются для эффективной экспрессии конститутивно активируемых зиготических генов. Авторы полагают, что первичная функция энхансеров заключается в предотвращении репрессии “слабых” промоторов за счет локального изменения структуры хроматина.

Специфическое усиление экспрессии генов на 2-клеточной стадии развития мыши осуществляется за счет наличия у генов участков, взаимодействующих с ускоряющим транскрипцию фактором 1 (TEF-1).

Активация зиготических генов происходит на 2-х клеточной стадии и

является критическим событием для перехода от материнского к эмбриональному контролю развития. Скорее всего здесь действуют так называемые “zygotic clock” (Schultz et al., 1993). Фосфорилирование материнских белков, катализируемое сAMP-зависимой протеинкиназой, может быть одним из механизмов активации зиготических генов (Schultz, 1993, BoiAssays,15, 531).

Синтез РНК увеличивается на стадии 8-клеточного зародыша и от 2-клеточного до раннего бластоциста возрастает в 6 раз. Параллельно возрастает и синтез белка. У зародышей второго типа (с большими яйцами) синтез РНК резко усиливается на более поздних стадиях (например у вьюна на стадии средней бластулы, когда имеется уже около 1000 клеток).

Быстро меняющийся темп и качественные изменения характера транскрипции связаны не только с таким фактором, как состояние хроматина, но и с димамикой синтеза ДНК-зависимых РНК-полимераз. В ооцитах имеется большой запас РНК-полимераз (у амфибий, например, из в 4х10⁵ раз больше, чем в соматических клетках). Активация транскрипции при развитии эмбрионов связана с переходом РНК-полимераз из цитоплазматических фондов в ядра.

Состав мРНК, синтезирующихся на разных стадиях развития, отличается, хотя имеются некоторые виды, которые являются общими для разных стадий. Общими являются мРНК, кодирующие белки домашнего хозяйства. В целом, отмечается как снижение суммарной сложности мРНК по мере дифференцировки клеток, так и увеличение. Снижение наблюдали, например, у морского ежа, а увеличение у лягушек.