Фт, участвующие в репрограммировании и поддержании тотипотентности (слайд 131)

Oct3/4: содержит специфический POU-домен, регулирует экспрессию др. специфических генов: Nanog, Sox2, подавляет такие сигнальные пути как FGF-путь, Wnt -путь, BMP и ряд др.

Sox2: содержит HMG-box, ответственен за пролиферацию ЭСК и развитие глаза. Взаимодействует с Oct3/4 и кооперирует с Oct3/4 в промотрах свыше 300 различных генов.

с-Myc: содержит helix-loop-helix/leucine zipper domain обладает онкогенным потенциалом, ингибирует дифференцировку, стимулирует пролиферацию.

Klf4: Крюпель-подобный фактор 4 содержит цинковые пальцы. Моделирует ацетилирование гистонов, может выступать как активатор и как репрессор других генов. Обладает как онкогенным, так и антионкогенным действием (онкоген в раке груди, антионкоген в в кишке).

Это послужило основой к созданию уже упоминавшихся индивидуальных! индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)!!! Удалось реализовать обратный вариант: получить стволовые клетки из соматических клеток взрослого организма. Оказалось, что для этого достаточно только экспрессии 3-4 различных белков, среди который с-myc и oct-3/4, Sox2, и Klf4!!! (отобрапи среди двух десятков ключевых). Все это гены кодируют не факторы роста, а другие факторы – факторы транскрипции!!! Это важнейший шаг в сторону создания клеточной терапии.

Важный момент – выяснилось, что в реальной ситуации выключение генов коктейля Яманаки осуществляется в эмбрионах также с помощью РНК-интерференции!!!! В эксперименте ыяснилось, что к направленной дифференцировке ЭСК приводила не только добавление определенных факторов, но и инактивация отдельных генов в ЭСК: RNAi-mediated silencing of OCT4 and SOX2 induced differentiation with mesodermal characteristics.

ФТ безусловно играют самостоятельную роль, но в целом организме они чаще всего действуют в каскадах, в которые входят и др. регуляторные молекулы и, в частности, ФР. Но сегодня речь идет о ФТ.

Мышечноспецифические факторы транскрипции в онтогенезе.

Сейчас на молекулярном уровне хорошо изучены многие моменты участия ФТ в эмбриональной дифференцировке клеток млекопитающих, хотя еще далеко не все.

Один из них - переход мезенхимного предшественника к терминально дифференцированным клеткам мышечной мускулатуры. В этом принимают участие как убиквитарные (вездесущие), так и специфические факторы.

3 Типа мышц:

Скелетные, гладкие и сердечные мышцы имеют происхождение из разных популяций мезодермальных клеток-предшественников.

Скелетные мышцы происходят из сомитов, сердечные - из передней латеральной пластинки, гладкие - из различных типов клеток, включая нервный гребень. Как осуществляется комбинаторная регуляция, приводящая к возникновению разных типов мышечных клеток?

Все типы мышечных клеток экспрессируют множество одинаковых мышечно-специфических генов. Наряду с этим в каждом из клеточных типов имеется свой набор специфически экспрессирующихся генов. Это обусловлено наличием специфических модулей в генах и специфических транс-действующих факторов транскрипции. Слайд 128.

Среди множества ФТ один - MEF-2 - обеспечивает экспрессию генов во всех типах мышечных клеток.

MEF-2 (myocyte-specific enhancer-binding factor 2), специфически связывающийся с мышечноспецифическим промотор-энхансерным консенсусом генов всех 3 типов мышц (Yu et al., 1992). Наличие MEF-2-связывающего места обязательно для всех мышечных энхансеров. Белки семейства MEF2 кодируются тремя генами, но за счет альтернативного сплайсинга на одном из генов в клетках образуется больше, чем 2 белка (слайд 129).

Транскрипты MEF-2 возникают в разных типах клеток, но соответствующие белки накапливаются за счет определенного сплайсинга преимущественно в ядрах скелетной и сердечной мускулатуры, то есть тканеспецифическая активность MEF-2 определяется регуляцией на посттранскрипционном уровне – на уровне сплайсинга.

Выяснилось, что экспрессию гена MEF-2 регулирует фактор BMP-2 (ФР) и MyoD (ФТ).

Субпрограмма регуляции генов в скелетных мышцах

Из 3-х генов MEF-2 только нокуат гена Mef2c приводил к дезорганизации миофибрилл и перинатальной летальности, происходила дезорганизация саркомеров. При этом на начальном этапе при эмбриогенезе образовывались нормальные миофибриллы. Связано это с тем, что MEF-2 регулирует в норме образование миомезина (участвует в упаковке миофибрилл).

Как единичный фактор MEF-2 не способен обеспечивать специфический мышечный фенотип. Он взаимодействует с генами в сочетании с другими ФТ. В скелетной мускулатуре таким дополнительным фактором является MyoD. Этот фактор является членом специфического семейства ДНК-связывающихся белков, имеющих структуру, названную basic helix-loop-helix (bHLH proteins), и встречающихся только в скелетной мускулатуре. Базовые ДНК-связывающие домены двух полипептидов соединены в данном случае структурой спираль-петля-спираль. Таким образом, вместо лейциновой застежки структура спираль-петля-спираль обеспечивает димеризацию регуляторных полипептидов.

В энхансерах и промоторах мышечно-специфических генов обнаружен Е-box, с которым и взаимодействуют гены семейства MyoD. Эти белки формируют гетеродимеры с т.наз. Е-белками, что способствует более прочной связи с Е-боксом.

При этом не все гены, экспрессирующиеся в мышцах, имеют E-box, а его присутствие не гарантируют эффектную экспрессию в мышцах. Следовательно, существуют и иные факторы, определяющие специфическую транскрипцию генов в мышцах. В частности показано, что для HLH белков существуют еще еще один Е-бокс консервативных домена на ДНК - E1 и E2-box, с которым связываются некоторые из них, в частности с E2 - MyoD.

Другие факторы, участвующие в развитии скелетных мышц - Myf-5, Myf-6 и миогенин - также связываются с Е-боксами. Факторы MyoD и Myf-5 (каждый из них в отдельности) достаточны для формирования скелетных миобластов.

Миогенин действует на более поздних стадиях и незаменим для терминальной дифференцировки миотрубочек. А вот фактор Myf-6, по-видимому, не играет важной роли в этих процессах. Такие выводы сделаны на основании анализа мышей с таргетированными генами.

Имеется различие даже в программах транскрипционной регуляции одних и тех же генов в скелетных мышцах разных органов.

Иллюстрирует это слайд 130. На примере гена миогенина показано, что он по-разному экспрессируется в сомитах и почке конечности. Этот ген содержит в своем регуляторном модуле 2 основных элемента: MEF-2 и MRF+E. Соединяли их с геном репортером: мутации в первом приводят к исчезновению экспрессии репортерного гена (lacZ) в почке конечности, мутации во втором - нет экспрессии в почке и снижение в сомитах, мутации в обоих - нет экспрессии нигде.

Другой пример - ген дисмина. Он имеет MEF-2-связывающее место и Е-box. Только мутации в обоих уменьшали его экспрессию (Li e a., 1994).

Сущеcтвует сложное взаимодействие между ФТ. Так, MyoD индуцирует ген MEF-2. Но сам MyoD инактивируется другим фактором Id, который образует гетеродимер с MyoD (Evans et al., 1993). Id экспрессируется в специфической популяции пролиферирующих мезенхимных и эпителиальных тканях и его экспрессия падает по мере дифференцировки.

Сверхэкспрессия Id ингибирует дифференцировку скелетных мышечных клеток. Следовательно, здесь, как и в случае факторов роста, действует механизм ингибирования. MyoD – индуцирует MEF2, Id – ингибитор MyoD.

В свою очередь ген миогенина и один из генов Mef2 подавляются специфическим репрессором транскрипции, который связывается с их промоторами – Hey1 – ингибитором миогенной дифференцировки!