Субпрограмма регуляции генов в сердечных мышцах.

Для развития сердечных мышц важным являются несколько транскрипционных факторов Id, GATA-4 и 5. Для пролиферации развивающихся кардиомиоцитов - Foxm1 (показано с помощью siRNA). Слайд 131.

1) Нокаут генов, кодирующих Id (а их более 3-х), приводит к серьезным нарушениям развития сердца. Причем это происходит, лишь когда нокаутируются сразу 2 или 3 гена, а не один из них. Гибель эмбрионов при этом происходила на 12-ый день развития. Чтобы понять механизм, были проведены эксперименты по получению химер (бластоциста с нокаутированными генами + нормальные ЭСК). Применив технологию чипов, которая позволяет определить, что происходит в картине экспрессии генов, было обнаружено, что некоторые из них реагируют сильно на нокут. Как выяснилось, добавление этих генов, или белков, которые они кодируют, спасало ситуацию. Таковыми оказались инсулин-подобный ФР-1 и WNT5a. Вот пример обнаружения причинно-следственной взаимосвязи в определенном процессе.

2) GATA-4 – другой транскрипционный фактор, участвующий в субпрограмме регуляции развития сердечной мышцы. Он имеет структуру цинковых пальцев. В раннем развитии этот ФТ преимущественно экспрессируется в клетках-предшественниках сердечных мышц. Нокаут одновременно GATA-4 и GATA-5 – гибель, в отдельности – нет.

Интересно, что этот же фактор участвует и в эритроидной дифференцировке. Следовательно, как и ФР, ФТ могут участвовать в нескольких различных типах клеточной дифференцировки.

Некоторые взаимосвязи между разными факторами транскрипции в сердечных мышцах (Слайд 132).

3) FOG-2 – фактор, содержащий «цинковые пальцы», конкурирует с GATA-4 и ингибирует его действие.

Кроме того, существуют еще 2 фактора: HAND-1 и HAND-2. При нокауте гена HAND-2 не развивается правый желудочек сердца. Нарущается регуляция экспрессии кардио-специфических генов!

Субпрограмма регуляции генов в гладких мышцах.

1. Дифференцировка гладких мышц (SMCs) сопровождается транскрипционной активацией ряда мышце-специфических генов, которые обеспечивают уникальные контрактильные и физиотлогические свойства мышечным клеткам этого типа. Большинство гладкомышечных генов контролируется с помощью serum response factor (SRF), широко экспрессирующегося транскрипционного фактора, который также регулирует гены, участвующие в клеточной пролиферации и служит ключевым регулятором образования мезодермы. (Слайд 133).

Myocardin и myocardin related transcription factors (MRTFs) взаимодействуют с SRF и сильно стимулируют SRF-зависимую транскрипцию. Эксперименты с избыточной и потерей функции показали, что миокардин достаточен и необходим для дифференцировки гладких мышц. Эти мышцы высоко пластичны и могут переключаться с дифференцированного на пролиферативное состояние в ответ на внеклеточные сигналы. Ассоциация SRF с myocardin и MRTFs создаёт молекулярную основу для активации генов гладких мышц с помощью SRF и для чувствительности программы гладкомышечной дифференцировки к передаче сигналов фактора роста.

Я уже говорил об индукции клеток нервного креста фактором роста TGF-beta, приводящей к формированию клеток гладкой мускулатуры. Кроме этого, недавно показано, что имеется специфический для этого типа клеток регуляторный ген SM22alpha, который действует в сочетании с уже упоминвшимся убиквитарным фактором сыворотки (SRF - serum responce factor).

Каждый из основных типов мышечных клеток состоит в свою очередь из разных популяций (субтипов). Это требует наличие дополнительной позиционной информации при миогенезе. Как показали эксперименты по нокауту, за нее ответственны отдельные гены HOX ( о них мы поговорим позднее).

Важным фактором для развития мышечных клеток является продукт онкогена c-met (клеточный рецептор тирозинкиназы) (Bladt et al., Nature, 1995, 376, 768). При его нокаутировании нарушалась миграция миогенных клеток-предшественников в почку конечности и диафрагму, но скелетная мускулатура развивалась нормально.

В мышечной дифференцировке важную роль играют и ранее не известные микроРНК, напр., miR-1, plays important roles in controlling myogenic differentiation and созревании коммитированных клеток.

Нейроспецифические факторы транскрипции.

Они изучены хуже, чем мышечноспецифические.

В геноме мыши существуют почти 1445 генов, кодирующих транскрипционные факторы (ТФ) – белков, запускающих транскрипцию генов. Эти факторы не только тканеспецифичны, но и действуют на разных стадиях эмбрионального развития. Большинство из выделенных ТФ (1174) оказались специфичными для мозга.

Слайд 134.

В общей сложности удалось выделить 33 больших семейства ТФ. В одно из них входят факторы, молекулы которых имеют раздвоенную наподобие вилки головку – Forkhead, или сокращенно Fох. К этому классу относится, например, фактор Fох Р, который управляет развитием нервных клеток, отвечающих за язык и речь. Другой ТФ из класса Fох регулирует продолжительность жизни клеток (и всего организма) на фоне умеренного голодания.

Транскрипционный фактор Оlig требуется для нормальной работы олигодендроцитов, «окутывающих» нервные волокна миелиновой оболочкой. Роль ТФ заключается в правильном «избрании» пути дифференцировки, т.е. направлении незрелых предшественников по пути их превращения в миелинизирующие клетки и правильной реализации необходимых для этого генетических программ. С неправильным функционированием этих ТФ связаны такие демиелинизирующие заболевания, как рассеянный склероз.

В последние годы выявлено несколько bHLH-факторов, участвующих в регуляции нейрогенеза (Lee, Current Opinion in Neurobiol., 1997, 7, 13-20). Наиболее изучены из них NeuroD и Neurogenin (Слайд 134). Многие из нейроспецифических факторов содержат так называемый POU-домен. Среди них такие как семейства факторов Brn, Oct, факторы BETA, MASH-1. При нокауте MASH-1, например, обнаружили нарушение развития симпатических и парасимпатических ганглиев.

В зависимости от времени действия этих факторов они разделяются на детерминирующие и дифференциирующие. К первым относятся факторы семейств MASH и нейрогенин, которые экспрессируются на ранних стадиях развития. В частности, эксперименты по нокауту показали, что MASH-1 определяет нейрональную судьбу клеток. Ко вторым NeuroD.

Уже говорилось о том, что не все из этих факторов узкоспецифичны в своем действии (некоторые могут активировать транскрипцию и в других типах клеток). Так, миогенный фактор MEF-2, о котором говорилось выше, взаимодействует с MASH-1 в нервных клетках и это взаимодействие обуславливает активацию нейрональных генов. С другой стороны, нейроспецифический NeuroD способен обеспечить дифференцировку гепатоцитов в панкреатические клетки.

Синаптической экспрессии рецептора ацетилхолина (AChR) способствует нейрегулин. Нейрегулин является трофическим фактором, высвобождаемым двигательными нейронами, который необходим для регуляции синтеза AChR в нейромышечных соединениях. Нейрегулин способствует синтезу AChR как на уровне белка, так и мРНК.

Еще один момент, связанный с регуляцией дифференцировки нервной системы, заключается в том, что наряду с активацией транскрипции нейро-специфических генов работает механизм тканеспецифической инактивации этих генов в других типах клеток. Обнаружен фактор NRSF (neuron-restrictive silencer factor) (Schoenherr, Anderson, Science, 1995, 267, 1360). Он связывается со специфическим сайленсером, имеющимся у генов, и препятствует экспрессии нейроспецифических генов в ненейрональных клетках. В 1995 г. это был первый пример негативной регуляции при морфогенезе.

Другие негативные регуляторы, участвующие в нейрогенезе - это HES и уже упоминавшийся Id. Существуют целые семейства белков HES и Id (структура HLH) Id действуют как позитивные регуляторы клеточного роста и как негативные регуляторы клеточной дифференцировки; HES репрессирует ткане-специфичные ФТ.

Факторы семейства En.

Известными факторами нейронального развития являются факторы семейства En (Engrailed): En1 и En2. Оба этих фактора содержат гомеодомены. Они сходны между собой по структуре (55% гомологии аминокислот). Оба фактора экспрессируются в области среднего мозга, но в разное время: En1 - на стадии 1-ого сомита, а En2 - на стадии 5-ти сомитов. Интересные результаты получены в результате нокаута этих генов. Нокаут En1 приводил к гибели мышей, а нокаут En2 - к развитию с дефектами мозга. Эксперименты по нокауту другого гена - гена Wnt-1 - показали, что при этом нарущается развитие (недоразвиваются) средний и промежуточный мозг. Выяснилось, что ген En-1 является мишенью при передаче сигнала от Wnt-1.

Был применен новый вариант таргетинга: заменили структурную область En1 на структурную область En2. При этом En2 начинал экспрессироваться вместо En1 на более ранних стадиях развития и мыши не гибли. Это первый пример того, что у дивергировавших белков сохраняются сходные биохимические функции, и важно время их экспрессии (Hanks et al., 1995, Science, 269, 676). Т.е. продукты гена En1, нет, а дефекта тоже нет.

Факторы дифференцировки гематопоэтических клеток на разных стадиях развития организма

Как уже говорилось кроветворение на разных стадиях развития происходит в разных органах (КМ, желточный мешок, печень). При этом функционируют разные наборы генов. В частности, это проявляется в различиях между гемоглобинами клеток крови эмбриона, плода и взрослого организма. Как уже говорилось, гемоглобиновые гены двух типов (альфа и бета) располагаются в двух разных кластерах. Причем последовательность их расположения совпадает с той последовательностью, с какой они экспрессируются в ходе развития организма.

Выяснилось, что разные трансрегуляторные факторы оказывают свое влияние на дифференцировку гематопоэтических клеток на разных стадиях развития организма. Основные данные были получены опять же с использованием нокаута генов (Immunology Today, 1998, 19, N 5). Например, нокаут гена GATA-2 влиял сильнее на гематопоэз, происходящий в желточном мешке. При нокауте гена c-myb эмбрионы погибали на 15-ый день из-за острой анемии, что обусловлено нарушением гематопоэза в печени плода, но не в желточном мешке. Таким образом, в регуляции дифференцировки эритропоэтических клеток на разных стадиях онтогенеза участвуют разные наборы регуляторных факторов.

Другой важный момент: ФТ работают не только сами по себе, но и в сочетании с ФР, с онкогенами и антионкогенами, о которых мы говорили на прошлой лекции.

Пример: выяснилось, почему нокаут гена Rb приводить к нарушению эритропоэза (Слайд 135). Он действует на ФР!

Факторы, определяющие развитие лимфоидной системы

Говоря об этих факторах в первую очередь следует сказать о факторе Ikarus. Он важен для лимфоидной спецификации. Кодирующий ген из-за альтернативного сплайсинга способен кодировать 6-ть разных белков. Все они имеют структуру цинковых пальцев и дифференциально экспрессируются при развитии гемолимфопоэтической системы. Кроме того эти белки способны формировать около 20 различных гомо- и гетерокомплексов. Таково может быть разнообразие продуктов одного гена! Ikarus не только регулирует спецификацию в лимфоидной системе, но и контролирует пролиферативный ответ Т-клеток. Потеря этого гена приводит к потере контроля за ростом клеток и трансформацией зрелых тимоцитов (лимфомы).

Другой фактор - Jak-3. При нокауте гена, кодирующего этот фактор, выяснилось, что он нужен для развития В-клеток в костном мозге и функциональной компетентности зрелых Т-лимфоцитов (Thomas et al., 1995, Science, 270, 794).

Следует отметить, что все больше и больше появляется данных об участии миРНК в дифференцировочных процессах. В частности, миР-150 связывается с –Myb мРНК и деградирует ее. В норме c-Myb способствует начальным этапам созревания В-лимфоцитов, но затем он исчезает и клетки дифференциируются до зрелых В-лимфоцитов. За это исчезновение и отвечает миР-150. У трансгенных мышей, экспрессирующих с рождения повышенный уровень миР-150 нарушено образование про- и пре-В-лимфоцитов. При нокауте собственного гена миР-150, наоборот наблюдается повышенное образование незрелых В-лимфоцитов.