119

Лекция 6

Факторы, участвующие в эмбриональном развитии

В ранних опытах прошедшего тысячелетия по пересадке тканей от одних эмбрионов другим у многоклеточных организмов было показано, что ведущую роль в регуляции развития животных играют межклеточные взаимодействия. Было сделано предположение о том, что пути развития клеток регулируются секретируемыми сигнальными молекулами, и взаимодействие эмбриональных закладок через детерминацию и дифференцировку приводит к формообразовательному эффекту. В последние два десятилетия генетики и биохимики значительно продвинулись в изучении процессов распространения информации в онтогенезе.

Сегодня поговорим о тех молекулярно-генетических процессах, которые происходят при раннем развитии и определяют в конечном итоге этот процесс.

Уже известны многие метаболические пути возникновения огромного разнообразия клеточных типов и морфологических форм в процессе развития высших организмов. Эти сигнальные пути развития клеток регулируются различными секретируемыми сигнальными молекулами, а также взаимодействием эмбриональных закладок через детерминацию и дифференцировку , что приводит в конечном итоге к морфогенезу - формообразовательному процессу.

Многочисленные факторы принимают участие в эмбриональном развитии. Наибольший интерес представляют собой белковые факторы, которые относятся к разным типам: факторы роста (ФР), факторы транскрипции (ФТ), морфогены и др. Остановимся первоначально на ФР.

Факторы роста

Важным компонентом, влияющим на рост, пролиферацию и дифференцировку клеток млекопитающих, являются факторы роста (ФР) полипептидной природы. Представление о них было получено в экспериментах на культурах клеток, в которых было показано, что для нормальной пролиферации клеток in vitro необходимы некоторые белки сыворотки крови. ФР, как правило, обладают митогенным эффектом и этот эффект определяется взаимодействием со специфическими рецепторами. Действуют они в очень низких концентрациях (10^-9 -10^-11 М).

Факторы роста являются полифункциональными регуляторами и принадлежат к классу цитокинов (наряду с интерлейкинами и интерферонами).

Часто за пролиферацию конкретных клеток отвечает не один фактор, а их комбинация. Таким образом небольшое число ФР может обеспечивать большое число комбинаций.

Считается, что с помощью ФР осуществляется комбинаторная регуляция, которая заключается в создании большого разнообразия клеток за счет комбинации небольшого количества регуляторных молекул. Слайд 94: 25 факторов - 1000 типов клеток (в норме – около 350).

Первым из обнаруженных факторов роста белковой природы был фактор роста нервов (NGF, Рита Леви-Монтальчини, 1968), а затем фактор роста эпителия (EGF) и фактор роста тромбоцитов (PDGF) (Слайд 95). Искали эти факторы в гомогенатах тканей по их эффекту на деление и рост клеток в культуре. И название они получили по первому обнаруженному эффекту. В настоящее время известно около 100 таких факторов, относящихся к нескольким классам. ФР различаются по своей специфичности. Некоторые из них имеют широкую специфичность (PDGF, EGF), другие - узкоспецифичны (эритропоэтин).

Некоторые ФР могут влиять на пролиферацию, но не на рост клеток, другие, наоборот, обеспечивают рост, но не влияют на пролиферацию. Отдельные ФР (например, ФР из семейства TGF-бета) могут при определенных ситуациях вызывать ингибирование пролиферации.

Как уже говорилось, процессы дифференцировки и развития очень сходны у всех позвоночных животных. В частности, как теперь выяснилось, многие издавно известные в эмбриологии индуцирующие факторы, участвующие в детерминации тканевых зачатков у амфибий (они обнаруживались с помощью использования имплантатов) являются родственными тем, которые выявлены в настоящее время у млекопитающих. Так, вигетализирующий фактор, изучаемый много лет Тидеманом, индуцирующий эктодерму и мезодерму, из которых состоит вегетативная половина зародышей амфибий, оказался сходным с независимо выявленным фактором эритроидной дифференцировки (EDP) у млекопитающих, называемым также активином А (семейство факторов TGF-beta1).

Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами. Например, фибробласты размножаются в ответ на фактор роста фибробластов, а также фактор роста эпидермиса, PDGF и др. Все эти вещества являются митогенами (стимулируют митоз).

Классификация факторов роста сложна и довольно условна в связи со сходством в структуре и механизме действия с не­которыми пептидными гормонами.

Итак, свое действие на клетки факторы роста реализуют через специфические клеточные рецепторы, расположенные на поверхности клеток. Рецепторы состоят из 3 доменов: внешнего (N-концевого), трансмембранного и цитоплазматического внутриклеточногно (С-концевого). Различают 2 класса рецепторов ФР: с и без внутриклеточного тирозинкиназного домена (слайд 97). Рецепторы пронизывают мембраны воспринимающих клеток один или несколько раз, выступая с обеих сторон над ее поверхностью. Обычно активация сигнального пути начинается с прямого физического контактав неклеточного домена лиганда, поступившего в межклеточный матрикс с внешним участком трансмембранного рецептора на поверхности клетки.

Все факторы роста, взаимодействуя с рецепторами, включают каскад внутриклеточных сигналов. Типичный метаболический путь стимуляции пролиферации клеток факторами роста представлен на слайде 98. Каскад событий: на первом этапе активация осуществляется, как правило, за счет димеризации рецептора и самофосфорилирования тирозиновых остатков в цитоплазматической части рецептора, а далее рецептор фосфорилирует связывающиеся с ним в цитоплазме регуляторные белки.

В ядре типичные гены раннего ответа - это белки семейства Ras, Src, myc, fos и jun, они в свою очередь действуют на митоген-активируемые белки (МАР-киназы). Среди генов вторичного (задержанного) ответа – разнообразные циклины, участвующие в регуляции клеточного цикла.

Передача сигнала, поступающего от сигнальных молекул, осуществляется несколькими механизмами (слайд 98):

1. Фосфорилирование-дефосфорилирование (киназы и фосфатазы)

2. Вторичные мессенжеры (цАТФ, цГТФ, инозитолтрифосфат и др.).

3. Внутриклеточные сигналы – ГТФазы.

4. Са+-каналы.

5. В последние годы – оксид азота!! NO участвует в расслаблении эндотелия, в передаче сигнала между нейронами, в иммунном ответе. Образуется в результате дезаминирования аргинина до цитруллина (NO-синтетазы).

ФР выполняют функции сигналов, секретируемых посылающими клетками в межклеточное пространство. Специфичность проведения сигнала зависит от компетентности воспринимающих клеток, от их способности распознавать индукцию определенными рецепторами. Слайд 99.

В развивающихся эмбрионах различных представителей позвоночных и беспозвоночных животных межклеточные взаимодействия координируются набором разнообразных сигнальных путей. Вместе с тем, существенную часть межклеточных сигналов передает небольшое числов т.наз. основных сигнальных каскадов генов (TGF!!! Hedgehog (Hh)-, Wnt-, Notch-каскады), связанных с активностью определенных сигнальных молекул (лигандов, рецепторов и др.). В этом и проявляется комбиториальная регуляция развитийных процессов.

Передача сигналов может идти по короткой или длинной цепи, через активацию другого каскада, быть прямой или непрямой.

Семейство факторов роста опухолей типа бета (TGF-beta)

Опухолеродные факторы, имеющие сходство по аминокислотной последовательности и входящие в это семейство генов, участвуют и в процессах эмбрионального развития. Сюда входят активин А, ингибины А и Б, BMP 2 и 4, сам TGF-beta1 и др. (Слайд 100).

Сигнальный путь TGF-бета (Слайд 101).

Факторы этого семейства весьма консервативны в эволюции как по структуре, так и по функции. Показательны в этом отношении эксперименты по исправлению морфогенетического дефекта у дрозофилы с помощью человеческого гомолога. У дрозофил, мутантных по гену dpp, который относится к генам семейства TGF-beta, нарушено нормальное дорзально-вентральное паттернирование. Когда таким мутантам вводили гибридный ген, в котором мутация исправлена за счет вставки гомологичного гена человека (ген BMP4), эмбриональный дефект исчезал (Padgett et al., 1993). Таким образом, метаболический путь DPP-BMP4 сохранен функциональным по крайней мере на протяжении последних 600 млн. лет.

При ингибировании гена BMP-4 с помощью антисмысловой мРНК наблюдали вентрализирующий (брюшной) эффект на мезодермальные ткани, т.е. этот ген важен для дорзально-вентрального паттернирования (Steinbeisser at al., 1995). Выяснилось также, что BMP-4 является фактором перехода от эктодермальных клеток к нейрональным (здесь он выступает в роле ингибитора) и эпидермальным клеткам (здесь он является индуктором).

Отдельные факторы этого семейства, например, фактор TNF-бета1, по имени которого получило название этого семейство генов, может проявлять как активирующий, так и ингибирующий эффект, в частности он ингибирует нормальное развитие кожи, супрессирует пролиферацию эпидермальных клеток. Это было показано на модели трансгенных мышей (Sellheyer et al., 1993).

Одним из примеров участия некоторых ФР семейства TGF-beta в позитивной регуляции дифференцировки нейрональных тканей (слайд 102).

N euronal crest

BMP-2 TGF-beta1

N erve cells Neuregulin Smooth cells