2. Выявление живых и мертвых клеток.

Состояние клеток можно определить по удержанию цитоплазмы и по их способности к плазмолизу в гипертонических растворах. Для этой цели часто используют различные красители. Красители, окрашенной частью которых служит анион( кислотные красители), не проникают в живые клетки. Некоторые основные красители , окрашенной частью которых является катион, проникают в живые клетки, их называют витальными( прижизненными) красителями. Из витальных красителей для оценки жизнеспособности клеток чаще всего используют нейтральный красный (нейтральрот).

Цель работы: ознакомиться с методами, позволяющими выявить состояние растительных клеток с помощью их окрашивания.

Материалы и оборудование: микроскоп, предметные и покровные стекла, часовые стекла, стерильная палочка, препаровальная игла, лезвие безопасной бритвы, пинцет, кусочки фильтровальной бумаги, спиртовка, 0,1%-ный раствор нейтрального красного в дистиллированной воде.

Растения: луковица лука репчатого.

2.1. Окрашивание живых и мертвых клеток нейтральным красным.

Молекулы нейтрального красного не задерживаются в цитоплазме живой растительной клетки, а с участием аппарата Гольджи и тонопласта активно выделяются в вакуоль. Потому у живых клеток краситель накапливается в вакуоли, а ядро и цитоплазма остаются неокрашенными. У мертвых клеток, наоборот, цитоплазма особенно ядро абсорбируют краситель, а вакуолярном соке он не задерживается .потому у мертвых клеток ядро окрашивается ярко, а в меньшей степени цитоплазма, а вакуоли остаются неокрашенными.

Для окрашивания используют водный раствор нейтрального красного в концентрации 0,01% с реакцией среды, близкой к нейтральной. Этот раствор готовят непосредственно перед употреблением: 0,1%-ый раствор нейтрального красного , приготовленного в дистиллированной воде, разводят водопроводной водой.

Верхняя эпидерма чешуи лука очень удобна для получения препаратов живой эпидермы, т.к. она легко отделяется от подстилающей ткани без повреждения клеток. На вогнутой поверхности чешуи луковицы лезвием безопасной бритвы делают надрезы в виде небольших квадратиков. Уголок квадратика надрезанной эпидермы захватывают пинцетом, легко снимают ее с чешуи и помещают в раствор красителя на предметное стекло. Выдерживают в этом растворе 3-5 минут, затем, накрыв препаратным стеклом, рассматривают его при малом, а затем при большом увеличении. Для обнаружения окраски под конденсор микроскопа нужно ввести матовое стекло, и усилив яркость освещения.

При малом увеличении отчетливо видны розоватые и розовато-оранжевые вакуоли, накопившие краситель. Интенсивность их окраски в соседних клетках может быть разной, т.к. клетки различаются по скорости накопления красителя. Отсутствие окраски в цитоплазме и ядре этих клеток легко обнаружить при большом увеличении.

Окрашенные клетки « убивают», подержав предметное стекло над пламенем горелки до тех пор, пока над покровным стеклом не начнут появляться пузырьки. Затем снова рассматривают препарат под микроскопом.

После гибели клеток окраска их изменилась: ярко окрасилось ядро, менее ярко-цитоплазма, расположенная тонким слоем вдоль стенок, а в вакуолях окраска исчезла.

При взаимодействии на живые клетки эпидермы раствором краски, приготовленными на дистиллированной воде, рН которой равен 5,6 и ниже, чем у водопроводной воды, картина получается иная: вакуоли живых клеток, цитоплазма и ядро также остаются неокрашенными, окрашиваются только клеточные стенки. То же самое наблюдается при окраске слегка поврежденных клеток при неосторожном снятии эпидермы.