Реакції аглютинації, преципітації, нейтралізації"

Імунна відповідь

Комплекс реакцій на проникнення чужорідних агентів. Це ланцюг міжклітинних і міжмолекулярних взаємодій, який закінчується накопиченням антитіл або клітин-ефекторів.

Форми імунної відповіді

1. Гуморальна

2. Клітинна

3. Імунологічна толерантність

Фази розвитку імунної відповіді

1.Індуктивна (аферентна)

2. Проліферативна

3. Продуктивна (ефекторна)

4. Імунологічна пам'ять

Клітини імунної системи, які беруть участь в імунній відповіді

1. Макрофаги

2. Дендритні клітини

3. В-лімфоцити

4. Т-лімфоцити

Антигенпрезентуючі клітини

1. Макрофаги

2. Дендритні клітини

3. В-лІмфоцити

Гуморальні фактори (молекули), які беруть участь в імунній відповіді

1. Цитокіни: інтерлейкіни, Інтерферон у (ІФНу), трансформуючий ростовий фактор (ТРФ)

2. Адгезійні молекули, інтегрини.

3. Костимулюючі молекули.

4. Молекули системи НЬА (І або II класу)

Цитокіни

Медіатори міжклітинних взаємодій. Продукуються переважно активованими клітинами імунної системи, неспецифічні відносно антигенів і зумовлюють міжклітинні комунікації при імунній відповіді, запаленні, гемопоезі. Діють на клітини-мішенІ через спеціальні рецептори на клітинній мембрані. Гуморальну імунну відповідь зумовлюють і ругулюють Тх2 та цитокіни ГЛ-4,ІЛ-5,ІЛ-10.

Гуморальна антитільна Імунна відповідь (від лат. humor - рідина)

Реакція на проникнення в організм антигену при якій ланцюг міжклітинних і міжмолекулярних взаємодій закінчується ом специфічних антитіл.

Антитіла (Ат)

Специфічні молекули імуноглобулінів, що продукуються (синтезуються)

плазматичними клітинами при імунній відповіді на визначений антиген. Мають характерну загальну структуру: в основі тетромер - симетричний комплекс із двох легких і двох важких ланцюгів

Класи (ізотипи) імуноглобулінів (Іg)

В залежності від структури Іg (типу важких ланцюгів) визначають 5 класів: М, С, А, Е, О.Ізотип визначає біологічні властивості антитіл

Моноклональні антитіла

Антитіла до окремої антигенної детермінанти (епітопу), які синтезуються одним клоном клітин в гібрідомі та є однорідними за специфічністю. Використовують для визначення поверхневих структур (маркерів) клітин, а також мікроорганізмів

Головні властивості антитіл

1. Гетеронність

2. Специфічність

Специфічність антитіл

Властивість антитіл з'єднуватись тільки з тими антигенами, у відповідь на які вони синтезувались в організмі. Специфічність антитіл визначається V-доменом

молекули Іg (актиним центром).

Гетерогенність антитіл

Велика популяційна різноманітності (10 -10) зв'язувальних властивостей антитіл по відношенню до антигенів.

Практичне використання імунних сироваток

1. Для профілактики та лікування ряду бактеріальних інфекцій, збудники яких продукують екзотоксин (дифтерія, правець, ботулізм та інші)

2. Для діагностики: визначення антигенних властивостей мікроорганізмів з метою ідентифікації бактерій і вірусів

Реакції імунітету (серологічні реакції)

Специфічні реакції між антигеном і антитілом, які проводять in vitro з діагностичною метою, для визначення антитіл за допомогою звісного антигену, або для визначення антигену, за допомогою відомих антитіл. По зовнішньому прояву

останньої фази реакції одержали назву: аглютинації, гемаглютинації, гемолізу та

інші.

Реакція "антиген-антитіло" може реєструватися вимірювальним приладом за допомогою різних міток. Мітки повинні бути кон'юговані раніше або з антитілами, або з антигенами. Мітки можуть бути ферментними, радіонуклідними, флуорохромними. Відповідно викорстовують варіанти реакцій: імуноферментний аналіз (ІФА), радіоімунний аналіз (РІА), імунофлуоресцентний аналіз.

Фази ходу серологічних реакцій

1. Специфічна (між антитілом і інтигеном)

2. Неспецифічна, яка зумовлює зовнішній прояв реакції

Практичне використання серологічних реакцій

1. Діагностика інфекційних захворювань: серологічна (визначення антитіл в сироватці крові обстеженого), бактеріологічна або вірусологічна (визначення антигенних властивостей збудника, виділеного від хворого або носія).

2. Оцінка рівня поствакцинального імунітету.

3. Оцінка імунного статусу (стану імунної системи)

Діагностичний препарат для виявлення Аг

Імунна (діагностична) сироватка, яка містить специфічні антитіла до конкретного Аг

Діагностичні Імунні сироватки

В більшості випадків це антимікробні сироватки (наприклад, проти сальмонел, але можуть бути використані І антитоксичні (наприклад, протидефтерійна для визначення токсигенності збудника), які частіше використовують для лікування

Одержання діагностичних сироваток

Імунізація тварин (кроликів) відповідними мікробами або їх антигенами

Метод діагностики для виявлення специфічних антитіл, титр антитіл

Серологічний метод. Титр антитіл - найбільше розведення сироватки, де ще відбувається позитивна реакція

Діагностичний препарат для

виявлення Ат

Діагностикум, або Аг (напр. в реакції зв'язування комплементу)

Компоненти реакції аглютинації для визначення виду бактерій (бактеріологічний метод)

1. Чиста культура бактерій, яка визначається

2. Видова діагностична сироватка

3. Електроліт (фіз.розчин)

Компоненти реакції пасивної (непрямої) гемаглютинації для визначення Ат

1. Сироватка особи, яка обстежується

2. Еритроцитарний діагностикум (суспензія еритроцитів, на яких адсорбовано Аг)

3. Електроліт

Бактеріальні інфекції, при яких провідна роль в захисному імунітеті належить антитілам

Дифтерія, правець, газова гангрена, ботулізм І ін.

Препарати, які містять антитіла І які використовують з

лікувальною та профілактичною

метою

1. Антитоксичні сироватки

2. Специфічні Імуноглобуліни

(у- глобуліни).

Феномен аглютинації

Відбувається коли антитіла сорбуються на мікробіних клітинах або на інших корпускулярних антигенах, які під впливом антитіл склеюються в агрегати

(аглютинати)

Аглютиніни

Антитіла, які беруть участь в реакції

аглютинації

Аглютиногени

Антигени, які беруть участь в реакції аглютинації

Практичне використання реакції аглютинації

1 3 метою серологічної діагностики при якій специфічні антитіла в сироватці крові або в інших рідинах організму при Інфекційних захворюваннях і Інших патологічних станах.

2 Для ідентифікації бактеріальних антигенів при бактеріологічному методі діагностики інфекційних захворювань

Способи постановки реакції аглютинації

Пластинчата реакція аглютинації ставиться на скляних або фарфорових пластинках з гладкою поверхнею. Розгорнута реакція аглютинації ставиться в пробірках або в лунках полістеролових пластин з послідуючим розведенням сироватки, в які вносять однакові кількості антигена з послідучим взначенням титру антитіл

Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА)

Антигени адсорбовані на еритроцитах (овечих, курячих, 0-групи людини). Такий препарат називається еритроцитарний діагностикум. Навантажені антигеном еритроцити склеюються під впливом специфічних антитіл, які містяться в сироватці крові. Утворюються агрегати сенсибілізованих антигеном еритроцитів, які подібні на «парасольки». РНГА може також бути використана також для визначення антигенів. В цьому випадку використовуються антитільні еритроцитарні діагностикуми, які уявляють собою завись еритроцитів, на яких сорбовані специфічні до конкретних антигенів антитіла.

Реакція преципітації (РП) (механізм)

Взаїмодія розчинного антигуну (преципітиногену) і антитіла (преципітину) в присутності електроліту (0,85% розчин NaCl). Відбувається агрегація антигену, що проявляється помутнінням прозорої рідини і випаданням осаду (преципітату). Осад із розчину комплексів антиген-антитіло відбуається в діапазоні еквівалентних співвідношень концентрацій взаємодіючих молекул

Різновиди РП

РП в рідині відбувається при змішування розчинів антигена й антитіла або нашаруванні одного компонента на інший. В останньому варіанті на межі двох реагентів утворюється преципітат у вигляді кільця. Тому така реакція одержала назву реакції кольцепреципітації. Реакцію ставлять в вузьких пробірках з 0,1 – 05 мл реагентів.

Для визначення антигенів використовуються реакцію преципітації або дифузії в гелях агару або агарози. Суть реакції полягає в тому, що антиген і антитіло дифундують в порах гелю на зустріч один одному, взаємодіють між собою і утворюють комплекс, який осаджується у вигляді лінії преципітації.

РП є більш чутливою в порівнянні з реакцією аглютинації й дозволяє виявити специфічний антиген у дуже малих концентраціях. Тому реакції преципітації використовуються головним чином з метою визначення антигену.

Діагностичну преципітуючу сироватку готують шляхом імунізації кролів розчином антигену по спеціальній схемі. Одержану імунну сироватку титрують в реакції преципітації. Титром сироватки є найбільше розведення антигена, де ще утворюється преципітат

Практичне використання РП

РП використовується: при діагностиці ряда інфекційних захворювань – сибірки, чуми, туляремії, епідемічного цереброспінального менінгіту і ін. В якості антигенів використовують екстракти уражених органів, ліквор і інше, а в якості антитіл (преципітинів) – діагностичні преципітуючі сироватки.

РП використовується також для визначеня класів імуноглобулінів та для вивчення антигенної структури бактерій. Крім того, для визначення видової приналежності білків, зокрема білків крові в судовій практиці

Реакція флокуляції.

Антитоксична сироватка.

Анатоксин

Для визначення активності імунних антитоксичних сироваток і анатоксинів використовується реакція нейтралізації за феноменом флокуляції – помутніння в пробірці з сумішшю анатоксину (токсину) й антитоксину.

Антиген (екзотоксин) має біологічну (токсичну, отрутну) активність, яка нейтралізується (знешкоджується, зв'язується) за допомогою антитіл – антитоксинів, які містяться в антитоксичних сироватках. Ця серологічна реакція називається, реакція нейтралізації.

Антитоксичні сироватки одержують шляхом імунізації коней анатоксином, титрують in vivo (на чутливих до токсину лабораторних тваринах або in vitro в реакції флокуляції. Активність антитоксичних сироваток вимірюється в міжнародних одиницях (МО). За 1МО приймають дозу цієї антитоксичної сироватки, яка нейтралізує певну кількість DLM токсину.

Анатоксин одержують шляхом знешкодження екзотоксину розчином формаліну (в суміші 0,4%) та дії температури 40°С на протязі 4-х тижнів. Активність анатоксину визначається в імунних (антигенних) одиницях (АО) в реакції флокуляції. За 1 АЕ приймають мінімальну дозу анатоксину, яка реагує з 1 МО антитоксичної сироватки і виникає позитивна реакція флокуляції.

Антитоксичні сироватки використовуються для специфічної

профілактики інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксин (дифтерії, правцю, ботулізму, газової гангрени), а також при укусу гадюк.

Анатоксини використовуються в якості вакцин для специфічної профілактики вище указаних захворювань

Імуноелектрофорез

Імуноелектрофорез є поєднання двох методів – електрофорезу в гелі і наступної після нього імунодифузії. Цей поєднаний метод дозволяє розділяти молекули по електрофоретичній рухливості (між анодом і катодом) і ідентифікувати (визначати) їх по антигенній специфічності за допомогою гомологічних імунних сироваток. Спочатку з сумішшю антигенів проводиться електрофорез, частіше в агаровому гелі. Потім паралельно лініям руху антигенів вирізається канавка, в яку вноситься гомологічна антисироватка. В результаті дифузії антигени і антитіла мігрують в порах носія (агарового гелю) назустріч один одному, з'єднуються в зонах еквівалентності їх концентрацій і утворюють дугоподібні лінії преципітації, кількість, розташування і форми яких дають уявлення про кількісний і якісний склад досліджуваної суміші антигенів