Тема: вторичный морфогенез в культуре каллусных тканей растений in vitro

Клетки растений в каллусной и суспензионной культурах сохраняют свойство тотипотентности, то есть способности соматических клеток из разных типов тканей давать начало целому растению. Это свойство складывается из:

38

1) наличия полного набора генетического материала в растительных клетках (исключением являются ситовидные клетки флоэмы некоторых видов растений),

2) способности клетки растения легко переходить из

дифференцированного состояния в недифференцированное и наоборот, приводящей к образованию всех типов тканей,

3) потенциально неограниченной способности растительной клетки к делению. Подобные свойства у животных вполне сохраняются только в половых клетках - поэтому получение целого животного организма из соматических клеток сталкивается с очень большими трудностями.

Получение растений из недифференцированных тканей бывает необходимо для самых разнообразных целей, например, при использовании культуры тканей для повышения разнообразия исходного материала при селекции за счет сомаклональной вариабельности вместо мутагенеза, для размножения растений, для получения устойчивых форм растений после клеточной селекции, для получения трансформированных растений при генетической инженерии.

Морфогенез в каллусной и суспензионной культуре может идти несколькими путями: 1) образование соматических эмбриоидов, то есть образований, морфологически схожих с обычными зиготическими зародышами, возникающими при половом процессе, но в отличие от них формирующихся из соматических клеток, 2) органогенез, который бывает а) стеблевой, с образованием побега, б) флоральный, с образованием цветка, и в) корневой, с образованием корней. Для регенерации целого растения практическое значение имеет только два пути: стеблевой органогенез с последующим укоренением побегов на среде, содержащей ауксин, а также образование соматических эмбриоидов,

39

поскольку получить регенерацию целого растения из цветков или корней для большинства видов растений затруднительно. Кроме того, получение соматических эмбриоидов применяется для получения искусственных семян, представляющих собой соматический эмбриоид, окруженный специальными синтетическими оболочками, содержащими питательные вещества, стимуляторы, фунгициды. По мнению американских ученых, уже проводящих их производственные испытания, эта технология перспективна для культур, семена которых дороги и их производство затруднено в местных условиях. Для центра России такой культурой может быть, например, люцерна.

Работа 8. Регенерация растений из каллусных культур картофеля и моркови.

Для индукции морфогенеза в куллусной ткани ее пересаживают на другую питательную среду с измененным гормональным балансом, а во многих случаях и с другими концентрациями органических питательных веществ. В общем случае гормональный баланс меняют следующим образом: исключают из питательной среды 2,4-Д или заменяют его на пониженную концентрацию более мягкого ауксина (ИУК) и подбирают концентрацию цитокинина, стимулирующую морфогенез. Концентрацию углеводов можно снизить, чтобы остановить дальнейший рост каллуса, а уровень азотного питания должен быть достаточно высоким, поскольку синтез белка необходим для начала процесса регенерации. Для стимуляции этих процессов в среду можно добавить гидролизат белка. Большое значение при этом имеют видовые и сортовые особенности регенерации растений.

40

Регенерация в каллусе моркови начинается при удалении 2,4-Д, на безгормональной среде или в присутствии небольшой концентрации цитокинина, а регенерация в каллусах пшеницы и других злаков возможна только при дополнительном подавлении роста каллуса с помощью абсцизовой кислоты.

Одна из сред, рекомендованных для регенерации из каллусной ткани картофеля, представлена ниже.

Среда для регенерации из каллуса картофеля

(в мг/л):

Минеральные компоненты среды МС

Гидролизат казеина 1000 Биотин 0.05

Аденин 40 Фолиевая к-та 0.5

Инозит 100 Зеатин 1.0

Пиридоксин 0.5 ИУК 0.1

Глицин 2.0 Сахароза 2.4

Никотиновая кислота 5.0 Глюкоза 10.0

Тиамин 0.5 Маннит 36.4

Цель работы: Получение растений регенерантов из каллусных тканей.

Материалы: каллусная ткань из корнеплодов моркови и клубней картофеля; стерильные листы фильтровальной бумаги; стерильные среды для регенерации побегов на основе MС;

Оборудование: стерильные стаканы, стерильная чашка Петри; стерильные пробирки; скальпель, пинцеты; спиртовая горелка.

Ход работы:

1. Разлить по пробиркам питательные среды для регенерации.

2. Извлечь каллусы из пробирки и положить на кружки стерильной фильтровальной бумаги в чашках Петри. С помощью стерильного инструмента расчленить их на

41

фрагменты с линейными размерами около 0.5 см.

3. Кусочки каллуса поместить на поверхность застывшей питательной среды для регенерации.

4. Спустя 2,4,6 и 8 недель провести наблюдения, отметить и зарисовать последовательное образование уплотнений, окрашенных в зеленый цвет, меристематических очагов и побегов.

5. Побеги перенести на среду укоренения.

6. В случае образования эмбриоидов, что вероятно для каллусов моркови, рассмотреть их под микроскопом и периодически наблюдать за их развитием.

Контрольные вопросы: 1. Что такое тотипотентность? 2. Почему из соматической клетки растений можно получить целый организм, а из клетки животных – нет? 3. Какие пути регенерации растений представляют практический интерес? 4. Что такое искусственные семена? 5. Какие изменения нужно внести в состав питательной среды, чтобы индуцировать морфогенез?

Работа 9. Регенерация растений из листовых эксплантов малины

Показано, что в образовании очага регенерации принимает участие небольшое число клеток исходной дифференцированной ткани или даже одиночные клетки. В любом случае эти клетки должны потерять исходную специализацию, перейти к делению, а затем вновь дифференцироваться в резличные типы специализированных клеток регенеранта. Глубина дедифференцировки, количество делений недифференцированных клеток, скорость и характер их вторичной дифференцировки могут различаться. Поэтому при регенерации из дифференцированных тканей можно выделить несколько вариантов протекания этого процесса.

42

При быстрой редифференцировке клеток без видимого каллусообразования говорят о прямой регенерации, а при значительном каллусообразовании – о регенерации из первичного калуса. Четкой границы между этими вариантами нет, но в первом случае чаще регенерация идет по типу стеблевого морфогенеза, а во втором – эмбриоидогенеза. На листовых эксплантах малины наблюдаются оба варианта с преобладанием одного из типов регенерации в зависимости от генотипа используемого растительного материала. Поэтому на некоторых формах малины наблюдаются две волны регенерации – первая по типу прямой регенерации через 3-4 недели от начала опыта и вторая – из каллуса, еще через несколько недель. Тип регенерации можно подтвердить при микроскопическом изучении срезов формирующихся регенерантов. При прямой регенерации – ткань мезофила переходит без четкой границы в ткани регенеранта, а его сосудистые пучки оканчиваются в мезофиле, а во втором случае после прослойки каллусной ткани видны эмбриоидоподобные структуры, ограниченные от неё слоем эпидермальных клеток.

При регенерации растений малины из листовых экплантов значительно лучшие результаты получаются при иапользовании цитокининов из структурного ряда дифенилмочевины – тидиазурона, производных пиридилфенилмочевины, по сравнению с более обычными цитокининами производными аденина. Концентрация тидиазурона 0.2 мг/л оказывается наиболее универсальной – она относительно эффективна для различных сортов, хотя степень регенерации и оптимальные концентрации могут значительно различаться.

Полученные побеги-регенеранты переносят на среды с 6-БАП для дальнейшего размножения или на среды с ауксинами для получения укорененных растений.

43

Общая частота регенерации зависит от генотипа, состава среды, прежде всего гормонального, и физических условий регенерации. При исследовании новых генотипов в опыт нужно включать уже изученные формы в качестве контроля и варьировать условия регенерации. Эта работа может быть основой для выполнения курсовых и дипломных работ.

Материалы: Пробирочные (стерильные) растения различных форм или сортов малины; стерильные листы фильтровальной бумаги; стерильные среды для разных этапов регенерации на основе MС, спиртовые растворы фитогормонов

Оборудование: Ламинарный бокс; стерильные стаканы, стерильная чашка Петри; стерильные пробирки Флоринского; скальпели, пинцеты, крючки для извлечения растений из пробирок; спиртовая горелка.

Ход работы:

1. Расчитать необходимый объём исходного (запасного) раствора тидиазурона с концентрацией 0.5 мг/мл для получения в готовой среде концентрации гормона 0.2 мг/л.

2. Разлить по пробиркам Флоринского или чашкам Петри питательные среды для регенерации.

3. Извлечь крючком пробирочное растение малины на стерильный кружок бумаги и отделить листья двух верхних ярусов, начиная с только развернувшегося. Для количественных опытов использовать только листья верхнего яруса, равномерно распределяя их по вариантам.

4. Обрезать края листьев и надрезать листовые жилки – раневые поверхности способствуют регенерации.

5. Разложить экспланты по поверхности питательной среды. Иногда результат бывает несколько лучше, если перевернуть экспланты верхней стороной к поверхности среды.

44

6. На 10 – 14 дней пробирки с эксплантами помещают в темноту. После чего проводят наблюдение, фиксируют состояние эксплантов и оставляют пробирки на рассеянном свету.

7. Окончательный учет количества регенерантов и перенос их на другие среды осуществляется через месяц.

Контрольные вопросы: 1. От каких факторов зависит часота регенерации из листовых эксплантов? 2. Какие структурные группы цитокининов существуют в природе? 3. Как влияет на регенерацию свет, возраст листа?