Методы стерилизации оборудования и материалов.

Посуда	Инстру-менты	Материалы	Раститель-ный материал	Рабочее место	Питательная среда
1) Сухим жаром в су-шильном шкафу при 160- 170 2 часа (кроме мерной посуды). 2) Автокла-вированием при давлении 2 атм., 25-30 минут (в т.ч. мерную посуду).	1) Обжиганием в пламени спиртовки в ходе работы. 2) Сухим жаром при 140, 2 .часа 3) Автокла-вированием. 4) Шприци и сверла путем кипячения.	1) Автокла-вированием при давлении 2 атм., 25-30 мин. (Вата, марля, фильтро-вальная бу-мага, ватные пробки и пр).	1) Ртутными препаратами: 0.1% сулема (HgCi2) и 0.1% диацид. Семена - 10-15 мин, расту-щие ткани - около 5 мин. 2) 70% спирт, 3) 13-20% Н2О2 4) 3-6% хлорамин 5) 10% гипохлорит натрия	1) Ламина-рный сте-рильный шкаф. 2) УФ об-лучением. 3) 70% спиртом. 4) Работа в стерильной зоне пламени.	1) Автокла-вированием при давлении 1 атм (120), 15-20 мин. 2) Стерили-зационным фильтрованием через фильтры с порами  0.45 мкм 3) Дробным кипячением (3 раза с ин-тервалом в сутки).

Примечания: 1. Для растительного материала применяется только химическая стерилизация. Лучшими стерилизаторами, особенно для нежных растущих тканей, являются препараты ртути, не проникающие в растительные ткани, но требующие отмывки в 4-6 сменах стерильной воды из-за высокой токсичности. 2. 70% спирт даже превосходит по стерилизующей способности 96% и меньше обжигает ткани. Спирт хорошо проникает в ткани растений – время стерилизации листьев 1-2 секунды. 3. Семена стерилизуются дольше – 10-20 минут для всех

9

стерилизаторов. 4. Холодная стерилизация сред фильтрованием применяется для разлагающихся при нагревании компонентов. Концентрированный стерильный фильтрат вливается в автоклавированный раствор агара.

Цель работы: Приготовление сред для следующих занятий.

Материалы: Пластиковые лодочки для взвешивания, калька, колпачки из фольги для колб или ватно-марлевые пробки; реактивы: неорганические соли, агар-агар, сахароза, гидролизат белка, витамины и фитогормоны. Оборудование. Стаканы химические на 1л, 0.5л по 1шт, на 0.15-0.25л - 4шт., полипропиленовые микропробирки с крышечками на 1.5мл или пенициллиновые флаконы на 10мл - 8-10шт., набор автоматических пипеток (автосамплеров) с диапазоном регулировки 2 – 1000 микролитров, мерные цилиндры на 0.5 и 0.2л. Весы технические и аналитические или торсионные, электроплитка, лабораторный рН-метр.

Ход работы

А. Приготовление минеральной основы среды МС.

Предварительно провести расчеты навесок всех необходимых компонентов среды и занести результаты в таблицу по приведенной ниже форме. В зависимости от массы навески использовать торсионные или технические весы. Все растворы приготовить на дистиллированной воде.

1.Приготовить два концентрированных маточных раствора, содержащих микроэлементы: а) 10мл 100000-кратного раствора, содержащего CuSO₄ и СоСl₂; б) 10мл 10000-кратного раствора KJ и Na₂МоО₄.

2. Взвесить соль железа и ЭДТА - из расчета на 5 литров

10

готовой однократной среды. Растворить навески в 50 мл воды в маленьком стаканчике и довести до кипения на электроплитке.

3. Навески остальных микроэлементов и макроэлементов, кроме соли кальция, растворить в большом стакане, добавить комплекс соли железа с ЭДТА и довести объем до 0.5л, получая 10-кратный раствор, который перелить в колбу для дальнейшего хранения.

4. Навеску соли кальция также рассчитать на 5литров готовой среды и растворить ее в 100 мл воды.

Маточные растворы	Компоненты	Навески	Конечный объем
Раствор 1а Раствор 1б Раствор 2 Раствор 3 Раствор 4	CuSO4 х 5Н2О CoCl2 х 6H2O KJ Na2МоО4 х 2Н20 Na2ЭДТА FeSO4 х 7Н20 KNO3 NH4NO3 MgSO4 х 7Н2О KH2PO4 H3ВО3 MnSO4 х 4Н2О ZnSO4 х 7Н2О CaCl2 х 2Н2O		10мл 10мл 50мл 500мл с учетом прилитого раствора 2 100мл

Примечание: Растворы 1а, 1б, 3 и 4 хранятся длительное время.

Б. Приготовление маточных растворов фитогормонов и витаминов.

1. Взвесить микропробирки, добавить в них небольшое количество кристаллического порошка фитогормона и

11

снова взвесить. По разнице весов расчитать навеску фитогормона, которая должна составлять от 2 до 7 мг, и по ее точному значению вычислить необходимый объем спирта, чтобы конечная концентрация гормона составила 5 мг/мл. После добавления спирта пробирки закрыть и встряхивать до растворения осадка. Спиртовые растворы являются стерильными и их можно добавлять в среду после ее автоклавирования (некоторые гормоны разлагаются при автоклавировании). При отсутствии аналитических весов отобрать по возможности более точно навеску фитогормона на лодочке из кальки с помощью торсионных весов.

2. Для питательных сред обычно используют аптечные растворы витаминов в ампулах. При их отсутствии приготовить маточные растворы витаминов в микропробирках или пенициллиновых флаконах, растворяя их в воде. Хранить в холодильнике.

В. Приготовление одной из сред, используемых на следующих практических занятиях (по указанию преподавателя).

Согласно прописи состава среды, указанной в тексте соответствующего практического занятия, и необходимого объема среды рассчитать и отобрать навески сахарозы, инозита, пептона и агар-агара.

Агар-агар сразу поместить в колбу, в которой будет проводиться автоклавирование среды, а остальные навески ссыпать в большой стакан. Туда же внести рассчитанные объемы воды, маточных растворов макро- и микроэлементов, и в последнюю очередь добавить раствор CaCl₂ при перемешивании.

2. С помощью автоматического дозатора внести рассчитанные аликвоты растворов витаминов и фитогормонов, используя одноразовые наконечники.

3. Довести рН полученного раствора до 5.8±0.1, добавляя при перемешивании раствор щелочи и контролируя рН с

12

помощью рН-метра.

4. Перелить раствор в колбу с навеской агара. Закрыть её ватно-марлевой пробкой или колпачком из фольги и проавтоклавировать 20 мин при 1 атм избыточного давления. После автоклавирования неостывший раствор нужно осторожно перемешать для равномерного распределения содержимого колбы и собравшегося на дне расплавленного агар-агара. Если такой возможности нет, то перед автоклавированием нужно раплавить агар-агар на электроплитке в небольшом количестве раствора и влить его при перемешивании в оставшуюся часть холодного раствора.

Контрольные вопросы:

1.В чем состоят различия органов и клеток растений по потребности в элементах питания в условиях in vitro по сравнению с целым растением? 2. Какие группы веществ входят в состав питательных сред для растительных тканей? 3. Перечислите 5 правил приготовления питательных сред. 4. Как можно стерилизовать растительный материал перед началом его культивирования in vitro? 5. Какие существуют способы стерилизации питательных сред? 6. Как обеспечить стерильность на рабочем месте?