Список использованных биологических терминов 44

Рекомендуемая литература 45

2

2. Тема: Основы техники культивирования тканей растений in vitro

Работа 1. Приготовление питательных сред для культивирования in vitro изолированных органов, тканей и клеток растений. Ознакомление с условиями стерильной работы и методами стерилизации сред, растительного материала, оборудования и рабочего места.

Для обеспечения роста и развития любой растительной ткани или органа растения, независимо от того находятся ли они in situ (то есть на своем месте, на растении) или in vitro (вне растения, в пробирке), требуется как соблюдение внешних физико-химических условий (освещенности, температуры, влажности, кислорода для дыхания, углекислоты для фотосинтеза), так и поступление элементов минерального и органического питания. Целые зеленые автотрофные растения нуждаются только в поступлении элементов неорганического питания, поскольку способны самостоятельно синтезировать все необходимые органические вещества. Однако разные ткани и органы различаются по своим биосинтетическим возможностям, между ними происходит постоянный обмен метаболитами. Некоторые ткани лишены хлорофилла и являются гетеротрофными. Кроме того нужно учитывать, что, как правило, при культивировании растительных эксплантов в закрытых пробирках фотосинтез затруднен, поэтому требуются более сложные по составу среды, обеспечивающие все потребности тканей или органов. Обычно культуральные среды для растительных эксплантов содержат следующие группы компонентов:

1. Неорганические макроэлементы в виде солей (N, P, K, S, Fe, Ca, Mg);

3

2. Неорганические микроэлементы (Co, Cu, Zn, B, Mo, Mn, J, иногда Ni);

3. Углеводы (чаще всего сахароза, глюкоза);

4. Аминокислоты (отдельные или чаще в виде смеси, получаемой при гидролизе молочного белка казеина и носящей фирменные названия "пептон" или "триптон");

5. Витамины (тиамин В1, пиридоксин В6, аскорбиновая кислота С, никотиновая кислота, и иногда другие);

6. Фитогормоны (обычно цитокинины, ауксины и гиббереллины);

7. Желирующие вещества (наиболее часто агар-агар);

Примечание: вещества 4,5 и 6 групп иногда могут заменяться частично или полностью растительными соками или экстрактами, обычно кокосовой водой, представляющей собой жидкий эндосперм кокосового ореха, богатый разными физиологически активными веществами.

Наличие компонентов первых трех групп является обязательным (иначе ткань перестает расти и погибает), а необходимость присутствия остальных веществ зависит от типа культивируемых тканей и поставленных целей. Углеводы являются основой гетеротрофного питания растений in vitro. Сахароза является главной транспортной формой углеводов у большинства растений. Их клетки и ткани приспособлены для усвоения сахарозы, и поэтому она хорошо поддерживает рост растительных эксплантов и является универсальной составной частью питательных сред. Другие сахара используются реже, обычно в виде добавок наряду с сахарозой.

Аминокислоты и витамины могут синтезироваться растительными тканями в условиях in vitro из сахаров и минеральных веществ, но их добавка может оказывать положительное влияние, особенно когда экспланты

4

состоят из небольшого числа клеток (например, меристемы при оздоровлении картофеля от вирусов) или когда связь между клетками ослаблена (например, при индукции образования и выращивании каллуса). В этих случаях в среду добавляется пептон и расширенный набор витаминов. При культивировании незрелых зародышей, особенно бобовых культур, накапливающих большое количество запасных белков, в среды для обеспечения достаточной скорости роста добавляется большое количество аминокислот, прежде всего глутамина и аспарагина, являющихся естественными транспортными формами азотных соединений в этих случаях.

Витамины являются коферментами, то есть входят в качестве простетической (небелковой) части в состав активного центра некоторых энзимов, обеспечивая их активность. Поэтому витамины улучшают адаптацию тканей, способствуют их росту. Аскорбиновая кислота является, кроме того, антиокислителем - препятствует окислению фенольных соединений.

Продукты окисления фенолов окрашивают среду и ткани в темный цвет и являются токсичными для растительных клеток. При реальной угрозе их образования содержание аскорбиновой кислоты можно увеличивать в несколько раз. Нужно помнить, что другие витамины могут проявлять фитотоксические эффекты (особенно тиамин) и превышать их концентрации не рекомендуется.

Компоненты среды, относящиеся к группе фитогормонов, играют особенную роль. Они не только стимулируют рост и деление клеток растений, но позволяют также направлять развитие экспланта в нужную сторону. Например, исходя из одного и того же кусочка ткани (экспланта), можно получить корни в присутствии ауксинов, побеги - в присутствии цитокининов или каллус - в присутствии обоих гормонов в определенном соотношении. Кроме ауксина и цитокинина, в составы

5

питательных сред иногда добавляют гиббереллин, который тоже относится к группе фитогормонов ростстимулирующего типа. Фитогормоны, относящиеся к ингибиторам роста (абсцизовая кислота и этилен), применяются только в особых случаях.

Желирующие вещества добавляют для регуляции консистенции среды, делая ее полужидкой или твердой. Это позволяет помещать растительную ткань на поверхность среды и обеспечивать тем самым одновременно хорошую аэрацию и снабжение элементами питания. Обычно для этих целей применяется агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей, который при охлаждении раствора образует крупноячеистую сетку за счет продольного "слипания" отдельных молекул в тяжи. В результате раствор теряет текучесть и становится твердым. Концентрация агар-агара при этом составляет всего около 0.7%, а при концентрации 0.5% среда становится полужидкой. Агар-агар не ингибирует рост растительных клеток в отличие от некоторых других желирующих агентов. Из неочищенного агар-агара выделены вещества, регулирующие поступление воды в ткани растений, при их недостатке может наблюдаться явление витрификации - ткань поглощает избыток воды, становится прозрачной ("стеклянной"), хрупкой и, в конце концов, погибает. Одним из способов борьбы с витрификацией является повышение концентрации агар-агара. Имеется ряд сообщений об успешном поиске более дешевых заменителей агар-агара, но эти вещества пока недоступны.

Подобрано достаточно большое количество составов питательных сред, сбалансированных по соотношению как минеральных, так органических компонентов. Самой популярной и универсальной минеральной основой для питательных сред является минеральная часть среды Мурасиге-Скуга.

6

Она характеризуется повышенным содержанием азота, расширенным набором микроэлементов и обеспечивает активный рост тканей растений. Поэтому она является основой для большинства сред, применяемых в практикуме.

Последовательность и правила приготовления питательных сред

Приступая к приготовлению питательных сред, в частности среды Мурасиге-Скуга (МС), нужно учитывать, что:

1. Минеральные среды готовятся в повышенных концентрациях (обычно 10-20-ти кратных) и могут храниться длительное время, а органические компоненты добавляются непосредственно перед стерилизацией и даже в некоторых случаях уже в стерильную среду (например, спиртовые растворы фитогормонов и термолабильных соединений или стерилизованные фильтрованием растворы аминокислот).

2. При приготовлении исходных концентратов минеральных сред соли кальция растворяются отдельно и добавляются к уже готовым средам. Это необходимо в связи с присутствием в составе сред фосфатов и сульфатов, которые могут образовывать с кальцием малорастворимые соли, выпадающие в осадок при высоких концентрациях исходных компонентов.

3. Некоторые микроэлементы используются в следовых количествах, и их навески трудно отобрать, поэтому их готовят в виде растворов с 1000-кратной или еще более высокой концентрацией. Причем желательно, чтобы соли меди и иодистый калий были разделены, так как при высокой концентрации возможна следующая реакция,

7

приводящая к потере микроэлементов в виде осадка:

4KJ + 2CuSO₄ = 2CuJ + J₂ + 2K₂SO₄

4. В небольшом объеме воды отдельно готовится раствор соли железа и ЭДТА и доводится до кипения для завершения образования хелатного комплекса. Затем раствор прибавляется к концентрату минеральной среды. Таким образом обеспечивается доступность железа для растительных клеток и предотвращается образование малорастворимых солей.

5. После приготовления среды однократной концентрации рН доводится до величины 5,8±0,1 с помощью раствора щелочи. Для большинства учебных задач используются среды, приготовленные на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (МС), которые отличаются между собой только составом органических компонентов. Среда МС отличается повышенным содержанием элементов питания и полным набором микроэлементов, и обеспечивает максимальную скорость роста для культур большинства видов растений.

Состав среды Мурасиге-Скуга (среда МС) в мг/л:

Макроэлементы: Микроэлементы:

KNO₃ 1900 H₃ВО₃ 6,2

NH₄NO₃ 1650 MnSO₄ х 4Н₂О 22,3

MgSO₄ х 7Н₂О 370 ZnSO₄ х 7Н₂О 8,6

KH₂PO₄ 170 KJ 0,83

CaCl₂ х 2Н₂О 440 Na₂МоО₄ х 2Н₂О 0,25

Na₂ЭДТА 37,3 CuSO₄ х 5Н₂О 0,025

FeSO₄ х 7Н₂О 27,8 СоСl₂ х 6Н₂О 0,025

Органические компоненты:

инозит 100

сахароза 30000

никотиновая кислота 0,5

пиридоксин 0,5

8

тиамин 0,1

аскорбиновая кислота 1,0

Вся работа с культурой тканей in vitro должна проводиться в стерильных условиях. Поэтому все среды, оборудование, материалы и части растений, помещаемые для культивирования на питательные среды, должны быть простерилизованы с помощью методов, приведенных в таблице 1.

Таблица 1.