9.3.2. Цикл ди- и трикарбоновых кислот

В опытах с дрожжами Л. Пастер обнаружил, что в присутствии кис-лорода снижается интенсивность брожения (превращение глюкозы в спирт), но одновременно наблюдается интенсивный рост биомассы дрожжей. В дальнейшем было показано, что усиление биохимической активности клеток дрожжей в аэробных условиях связано с функционированием дыхательного цикла, промежуточными продуктами которого являются органические кислоты. Анализируя полученные данные о влиянии органических кислот на дыхательные процессы, Г.А. Кребс в 1937 г. предложил последовательность реакций окисления лимонной кислоты до СО₂ и Н₂О, которую в дальнейшем стали называть циклом ди- и трикарбоновых кислот или циклом Кребса. Ферменты, катализирующие реакции цикла Кребса, локализованы в матриксе или во внутренней мембране митохондрий.

Непосредственно в реакции цикла Кребса вступает производное пировиноградной кислоты – ацетил-КоА, которое образуется в результате окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты, катализируемого мультиферментным пируватдегидрогеназным комплексом. Ферментный комплекс растворён в матриксе митохондрий и имеет молекулярную массу до 910⁶. Он состоит из трёх ферментов: декарбоксилазы, имеющей в качестве кофермента тиаминпирофосфат; дигидролипоилдегидрогеназы, содержащей ФАД; дигидролипоилтрансацетилазы, представляющей собой сердцевинный фрагмент в мультиферментном комплексе, имеющий остатки липоевой кислоты.

На первом этапе пировиноградная кислота взаимодействует с тиаминпирофосфатом декарбоксилазы, в результате чего от пировиноградной кислоты отщепляется СО₂ и происходит образование гидроксиэтильного производного тиаминпирофосфата (ТПФ):

СН₃

|

С=О +  + СО₂

|

СООН

пировиноград- тиазоловое кольцо гидроксиэтильное

ная кислота тиаминпирофосфата производное ТПФ

Затем гидроксиэтильное производное ТПФ взаимодействует с окисленной формой липоевой кислоты в составе фермента дигидролипоилтрансацетилазы. В ходе окислительно-восстановительной реакции гидроксильная группа переносится на остаток липоевой кислоты и превращается в ацетильную группу с образованием макроэргической связи СS, при этом дисульфидная связь липоевой кислоты восстанавливается:

+  +

гидроксиэтильное активная группа ТПФ ацетиллипоевая

производное ТПФ липоевой кислоты кислота

Под действием этого же фермента ацетильная группа с макроэргической связью переносится от ацетиллипоевой кислоты на кофермент А:

+ НS – КоА  + СН₃–СS–КоА

||

О

ацетил-КоА

ацетиллипоевая восстановленная

кислота форма липоевой

кислоты

В качестве продуктов данной стадии превращения пировиноградной кислоты образуются регенерированный тиаминпирофосфат, восстановленная форма липоевой кислоты и ацетил-КоА.

Восстановленная форма липоевой кислоты подвергается окислению под действием фермента дигидролипоилдегидрогеназы, который отщепляет электроны и протоны от восстановленной липоевой кислоты и передает их на окисленный НАД, в результате чего регенерируется окисленная форма липоевой кислоты и синтезируются восстановленные динуклеотиды НАДН:

+ ФАД  + ФАДН₂

фермент–ФАДН₂ + НАД⁺  фермент–ФАД + НАДН⁺ + Н⁺

Таким образом, конечными продуктами окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты являются ацетил-КоА, восстановленные динуклеотиды НАДН и СО₂. НАДН включается в различные восстановительные реакции, катализируемые дегидрогеназами, или, как мы увидим далее, становится донором электронов и протонов для системы окислительного фосфорилирования, локализованной в мембранах митохондрий. Ацетил-КоА, как и пировиноградная, щавелевоуксусная и -кетоглутаровая кислоты – важный промежуточный продукт обмена веществ организмов. Он используется для синтеза жирных кислот, углеводов и многих аминокислот и также образуется при их распаде.

Синтез ацетил-КоА в ходе окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты регулируется концентрациями АТФ и АДФ, а также НАДН и НАД⁺. Высокая концентрация АТФ аллостерически ингибирует пируватдегидрогеназный комплекс. При высокой концентрации НАДН также наблюдается ингибирование данного ферментного комплекса вследствие пониженной концентрации НАД⁺, необходимого для ренегенерации кофермента ФАДН₂ в окисленную форму ФАД.

В

СН–СООН СН₂–СООН (1)

|| + СН₃–СS-КоА + Н₂О  |

С(ОН)–СООН || С(ОН)–СООН + НS–КоА

енольная форма О |

щавелевоуксус- СН₂–СООН

ной кслоты лимонная

кислота

реакциях аэробного дыхания образовавшийся при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты ацетил-КоА включается в реакции цикла Кребса. Вначале происходит конденсация ацетил-КоА с енольной формой щавелевоуксусной кислоты, в ходе которой ацетильная группировка кофермента А соединяется с углеродной цепью щавелевоуксусной кислоты, в результате чего синтезируется лимонная кислота. Эту реакцию катализирует фермент цитратсинтаза (4.1.3.7):

Фермент цитратсинтазу аллостерически ингибирует повышенная концентрация АТФ. Поэтому при высокой обеспеченности клетки энергией, когда повышается концентрация АТФ, вследствие ингибирования цитратсинтазы меньше ацетил-КоА будет включаться в реакции цикла Кребса и больше использоваться на биосинтетические процессы.

В ходе дальнейших превращений лимонная кислота превращается в цис-аконитовую кислоту в результате отщепления молекулы воды под действием фермента аконитатгидратазы (4.2.1.3), локализованного во внутренней мембране митохондрий:

СН₂–СООН СН₂–СООН (2)

| |

С(ОН)–СООН  С–СООН + Н₂О

| ||

СН₂–СООН СН–СООН

лимонная кислота цис-аконитовая

кислота

В последующей реакции цис-аконитовая кислота под действием того же фермента присоединяет молекулу воды, превращаясь в изолимонную кислоту:

СН₂–СООН СН₂–СООН (3)

| |

С–СООН + Н₂О  СН–СООН

|| |

СН–СООН СН(ОН)–СООН

цис-аконитовая изолимонная

кислота кислота

Изолимонная кислота окисляется в щавелевоянтарную кислоту под действием НАД- или НАДФ-специфичного фермента изоцитратдегидрогеназы (1.1.1.41). Образовавшаяся щавелевоянтарная кислота самопроизвольно декарбоксилируется, превращаясь в -кетоглутаровую кислоту:

СН₂–СООН СН₂–СООН СН₂–СООН (4)

| НАД(Ф)⁺ | |

СН–СООН  СН–СООН  СН₂ + СО₂ + НАД(Ф)Н + Н⁺

| | |

СН(ОН)–СООН СО–СООН СО–СООН

изолимонная кислота щавелевоянтар- -кетоглута-

ная кислота ровая кислота

Фермент изоцитратдегидрогеназа ингибируется высокой концентрацией НАДН и аллостерически активируется лимонной кислотой. Это – опережающая активация, когда определённый метаболит (в данном случае лимонная кислота) активирует ферменты, катализирующие его последующие превращения.

Продукт реакции 4 -кетоглутаровая кислота подобно пировиноградной кислоте подвергается окислительному декарбоксилированию под действием -кетоглутаратдегидрогеназного ферментного комплекса, который имеет такой же состав и строение, как и пируватдегидрогеназный комплекс. В результате декарбоксилирования -кетоглутаровой кислоты образуется ацильная группировка янтарной кислоты, которая переносится на кофермент А с образованием макроэргического соединения сукцинилS–КоА. Суммарное уравнение процесса окислительного декарбоксилирования -кетоглутаровой кислоты можно представить в следующем виде:

СН₂–СООН СН₂–СООН (5)

| |

СН₂ + НS–КоА + НАД⁺  СН₂–СS–КоА + СО₂+ НАДН + Н⁺

| ||

СО–СООН О

-кетоглутаровая сукцинил-КоА

кислота

-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс ингибируется высокой концентрацией НАДН и аллостерически активируется АДФ и АМФ, тогда как при высокой концентрации АТФ действие ферментного комплекса подавляется.

В

ходе дальнейших превращений энергия макроэргической связи сукцинилS–КоА используется для синтеза АТФ, который осуществляется в процессе субстратного фосфорилирования и катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой (6.2.1.5). Вначале фермент образует макроэргическое промежуточное соединение с группировкой кофермента А, а ацильный радикал янтарной кислоты превращается в свободную янтарную кислоту. Коферментная группировка присоединяется к атому азота амидазольного кольца гистидина в каталитическом центре фермента. Затем группировка кофермента А в каталитическом центре фермента замещается на остаток фосфата с образованием макроэргического фосфофермента (фермент Р), от которого остаток фосфорной кислоты с макроэргической связью переходит на АДФ, осуществляя таким образом синтез АТФ. Суммарное уравнение процесса фосфоролитического расщепления сукцинил– КоА и сопряжённого с ним синтеза АТФ можно записать в виде следующей схемы:

СН₂СООН СН₂СООН (6)

| + Н₃РО₄ + АДФ  | + НSКоА + АТФ

СН₂СSКоА СН₂СООН

|| янтарная кислота

О

сукцинил-КоА

К

СН₂СООН HOOC H (7)

| \ /

CH₂COOH + ФАД  C=C + ФАДН₂

янтарная кислота / \

H COOH

фумаровая кислота

ак показано в представленных выше реакциях, у растений в результате фосфоролитического расщепления сукцинилКоА осуществляется синтез АТФ, тогда как в клетках животного организма в аналогичном процессе происходит синтез ГТФ с участием ГДФ. Образовавшаяся в реакции 6 янтарная кислота окисляется с участием фермента сукцинатдегидрогеназы, локализованного во внутренней мембране митахондрий. Сукцинатдегидрогеназа имеет в качестве кофермента динуклеотиды ФАД. В ходе этой реакции янтарная кислота превращается в фумаровую:

Сукцинатдегидрогеназа аллостерически ингибируется щавелевоуксусной кислотой и активируется АТФ и восстановленным убихиноном (КоQН₂).

В

НООС Н (8)

\ /

С = С + Н₂О  НООССН₂СН(ОН)СООН

/ \ яблочная кислота

Н СООН

фумаровая кислота

следующей реакции к фумаровой кислоте присоединяется молекула воды под действием фермента фумаратгидратазы (4.2.1.2) и образуется яблочная кислота:

В дальнейшем яблочная кислота окисляется в щавелевоуксусную кислоту с участием НАД-специфичного фермента малатдегидрогеназы (1.1.1.37):

СН₂СООН СН₂СООН (9)

| + НАД⁺  | + НАДН + Н⁺

СН(ОН)СООН СОСООН

яблочная кислота щавелевоук-

сусная кислота

Малатдегидрогеназа ингибируется повышенной концентрацией щавелевоуксусной кислоты и НАДН.

СН₂СООН СНСООН (10)

|  ||

СОСООН С(ОН)СООН

кетоформа енольная форма

щавелевоуксус- щавелевоуксусной

ной кислоты кислоты

Кетоформа щавелевоуксусной кислоты самопроизвольно превращается в свою енольную форму:

После этого енольная форма щавелевоуксусной кислоты может взаимодействовать с новой молекулой ацетилкофермента А и рассмотренный нами цикл реакций будет повторяться снова.

Если исключить промежуточные продукты, образующиеся в реакциях окислительного дикарбоксилирования пировиноградной кислоты и цикла Кребса, и записать только вещества, входящие и выходящие из этого цикла при условии полного прохождения всех указанных выше реакций, то можно получить следующее суммарное уравнение:

СН₃ССООН + 2Н₂О + 3НАД⁺ + НАД(Ф)⁺ + ФАД + Н₃РО₄ + АДФ 

||

О

 3СО₂ + 3НАДН + НАД(Ф)Н + ФАДН₂ + 4Н⁺ + АТФ

Исходя из этого уравнения видно, что пировиноградная кислота в ходе происходящих превращений окисляется с образованием трёх молекул СО₂ и пяти молекул восстановленных динуклеотидов НАДН, НАДФН и ФАДН₂. Источником кислорода для реакций окисления служат молекулы воды, две из них показаны в левой части уравнения и одна высвобождается при взаимодействии Н₃РО₄ и АДФ. Молекулы воды также являются донорами электронов и протонов для синтеза восстановленных динуклеотидов.

Как видим, прямого участия молекул кислорода в реакциях цикла Кребса нет, хотя указанные реакции активируются кислородом. Непосредственное участие кислорода в реакциях дыхания происходит на стадии окисления восстановленных динуклеотидов, образующихся при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты и в реакциях цикла Кребса, с участием ферментных комплексов, локализованных во внутренних мембранах митохондрий. И эти процессы будут рассмотрены далее.

Кроме восстановленных динуклеотидов, в цикле Кребса происходит также синтез АТФ из неорганического фосфата и АДФ путём реализации механизма субстратного фосфорилирования. Как мы увидим далее, при окислении восстановленных динуклеотидов также осуществляется синтез молекул АТФ, являющихся универсальными для многих организмов биоэнергетическими продуктами, способными осуществлять транспорт энергии в организме и участвовать в реакциях сопряжённого синтеза веществ.

В реакциях окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и цикла Кребса образуются не только важные биоэнергетические продукты, но и промежуточные метаболиты, с участием которых осуществляется связь обмена углеводов с обменом липидов, аминокислот, белков и других органических веществ в организме. Как было указано ранее, к таким веществам относится ацетил-КоА.

Важными промежуточными продуктами также являются щавелевоуксусная и -кетоглутаровая кислоты. В результате их аминирования синтезируются аминокислоты аспарагиновая и глутаминовая, которые занимают центральное место в обмене азотистых веществ и из этих аминокислот при их распаде образуются указанные выше кетокислоты. В результате оказывается возможным окисление аминокислот путём включения образующихся из них кетокислот в цикл Кребса.

Наряду с кетокислотами в цикле Кребса образуются лимонная и изолимонная, цис-аконитовая, янтарная, фумаровая, яблочная кислоты, через которые осуществляется связь цикла Кребса с обменом органических кислот. Благодаря тому, что при распаде липидов, изопреновых производных, ряда аминокислот и других азотистых веществ образуется ацетил-КоА, они могут использоваться в организмах как субстраты дыхания, так как получаемый в процессе их распада ацетил-КоА может включаться в реакции цикла Кребса и подвергаться полному окислению.

Если в ходе окисления ацетил-КоА в реакциях цикла Кребса промежуточные продукты не выводятся из цикла для синтеза других веществ, то происходит полная регенерация первого продукта, с которым реагирует ацетил-КоА,  щавелевоуксусной кислоты. Однако в реальных физиологических условиях из цикла Кребса постоянно потребляются на различные биосинтетические процессы те или иные промежуточные метаболиты, поэтому циклический ход регенерации щавелевоуксусной кислоты в этих случаях не завершается и для обеспечения хода реакций цикла необходимо постоянно поддерживать необходимую концентрацию щавелевоуксусной кислоты в матриксе митахондрий путём её дополнительного синтеза.

У растений и бактерий первичный синтез щавелевоуксусной кислоты осуществляется под действием фермента фосфопируваткарбоксилазы из СО₂ и фосфоенолпировиноградной кислоты:

СН₂ СН₂СООН

|| | + Н₃РО₄

СО Р + СО₂ + Н₂О  СОСООН

| щавелевоуксусная

СООН кислота

фосфоенол-

пировиноградная кислота

В животных клетках аналогичную функцию выполняет фермент пируваткарбоксилаза, катализирующий реакцию карбоксилирования пировиноградной кислоты:

СН₃ СН₂СООН

| |

С=О + СО₂ + Н₂О + АТФ  СОСООН + АДФ + Н₃РО₄

| щавелевоуксусная

СООН кислота

пировиноград-

ная кислота

Таким образом, цикл Кребса является связующим звеном в обмене различных групп органических веществ и конечным этапом их окисления. В ходе этих реакций высвобождается значительное количество энергии окисляющихся субстратов и связывается главным образом в виде восстановленных форм динуклеотидов НАДН и ФАДН₂, энергия которых используется для синтеза АТФ.

9.3.3. Окисление биоэнергетических продуктов цикла Кребса

Восстановленные формы динуклеотидов НАДН и ФАДН₂ подвергаются окислению молекулярным кислородом на заключительной стадии процесса дыхания у аэробных организмов. Их окисление катализируют ферментные комплексы, входящие в состав внутренней мембраны митохондрий. Первые сведения об окислении субстратов цикла Кребса кислородом воздуха были получены в 1925 г. Варбургом О.Г. и Кейлином Д., которые открыли действие фермента цитохромоксидазы, способного переносить электроны на молекулярный кислород.

В последующий период были выяснены все основные переносчики электронов и протонов от восстановленных динуклеотидов на молекулярный кислород, а в 1959 г. Чанс Б. по результатам спектрометрических исследований и на основе изучения действия специфических ингибиторов составил из них цепь дыхательных ферментов, которую в настоящее время называют электронтранспортной цепью митохондрий. По современным представлениям электронтранспортная цепь митохондрий включает следующие компоненты:

ФАДН₂

‌ 2ē,2Н⁺

‌

2ē,2Н⁺ 2ē,2Н⁺ 2ē 2ē 2ē 2ē 2ē 2ē

НАДН+Н⁺ФМНКоQцит.bцит.с₁цит.сцит.ацит.а₃1/2О₂Н₂О

 

2Н⁺

---------------------------------------------------

Как видно из указанной схемы, электроны и протоны от ФАДН₂ и НАДН передаются на кофермент Q, который превращаясь в восстановленную форму, является активным донором электронов для последовательности переносчиков, состоящей из цитохромов. А протоны высвобождаются в физиологическую среду и далее взаимодействуют с ионизированными атомами кислорода, образуя молекулы воды: 2Н⁺ + О^2-  Н₂О. Ионизация кислорода происходит в результате переноса на него электронов от цитохромной системы под действием фермента цитохромоксидазы, включающего в своем составе цитохромы а и а₃

Перенос электронов в электронтранспортной цепи митохондрий осуществляется в соответствии с общим химическим принципом от переносчика с более отрицательным стандартным окислительно-восстановительным потенциалом в направлении возрастания величины стандартного потенциала (табл. 12).

Кофермент Q, или убихинон, так же, как и пластохинон, относится к липидорастворимым производным хинона, содержащим в хиноидной группировке метоксильные группы и ненасыщенный изопреноидный радикал, включающий от 6 до 10 изопреновых группировок. У млекопитающих и растений в структуре убихинона имеются 10 изопреновых группировок. Кофермент Q способен присоединять 2 электрона и 2 протона и превращаться в восстановленную форму:

СН₃ СН₃

| 2ē,2Н⁺ |

–(СН₂–СН=С–СН₂)₁₀Н  –(СН₂–СН=С–СН₂)₁₀Н

окисленный восстановленный

убихинон убихинон

Окисленную форму убихинона принято записывать в виде символа КоQ или Q, восстановленную форму – КоQН₂.

Большинство ферментов электронтранспортной цепи митохондрий связаны c их внутренней мембраной, которая имеет большую плотность по сравнению с внешней мембраной и содержит в своем составе больше