9.3. Дыхание

Основной источник энергии для поддержания процессов жизнедеятельности у гетеротрофных организмов – это химическая энергия органических веществ, которые они используют в качестве пищи. Несинтезирующие органы растений, а в темноте и способные к фотосинтезу клетки также используют в качестве источника энергии органические вещества, образующиеся как продукты фотосинтеза. Для того чтобы химическая энергия органических веществ могла использоваться для поддержания жизнедеятельности организма, они подвергаются окислению. При этом на каждом этапе окислительного распада веществ выделяется энергия, которая связывается в ходе определённых реакций в виде макроэргических соединений и восстановленных динуклеотидов и может затем использоваться для осуществления эндергонических процессов, связанных с синтезом, транспортом и активированием различных химических веществ. В ходе биологического окисления образуются промежуточные метаболиты, которые затем участвуют в синтезе конечных продуктов, выполняющих в организме те или иные биологические функции (структурные, запасные вещества и др.).

Последовательность биохимических реакций, лежащих в основе биологического окисления, называют дыханием. У растений и других высших организмов в реакциях дыхания участвует кислород, а в качестве продуктов дыхания выделяются СО₂ и Н₂О. Первые сведения о дыхании растений были получены Я. Ингенхаузом (1778 г.), а к концу 19 века было установлено общее уравнение дыхательного процесса:

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂  6СО₂ + 6Н₂О + G, (1)

где С₆Н₁₂О₆ – моносахариды, образуемые при фотосинтезе.

В дальнейшем благодаря работам В.И. Палладина (1912 г.) было показано, что на первом этапе дыхательных реакций происходит отщепление водорода от молекул сахара и воды и образование промежуточных восстановленных продуктов, а на следующем этапе эти продукты уже окисляются кислородом с образованием воды. Поэтому дыхательный процесс можно представить в две стадии:

С₆Н₁₂О₆ + 6Н₂О  6СО₂ + 24Н (2)

24Н + 6О₂  12Н₂О (3)

Если из уравнений (2) и (3) составить суммарное уравнение процесса, то мы получим уравнение (1).

В 1921–25 г.г. в опытах по изучению роли фермента цитохромоксидазы О.Г. Варбург и Д. Кейлин установили, что на второй стадии дыхания на кислород переносятся электроны и протоны, которые и участвуют в образовании молекул воды:

О₂ + 4ē + 4Н⁺  2Н₂О

Отщепление электронов и протонов от молекул сахара и воды, как было выявлено в ходе дальнейших исследований, катализируют ферменты дегидрогеназы и с их участием происходит образование восстановленных динуклеотидов НАДН и ФАДН₂, при окислении которых и осуществляется перенос электронов и протонов на кислород.

По современным представлениям процесс дыхания у растений состоит из трёх стадий: гликолиза, цикла ди- и трикарбоновых кислот и окисления восстановленных динуклеотидов, образующихся на первых двух стадиях дыхания, с участием ферментных комплексов, локализованных во внутренних мембранах митохондрий.

9.3.1. Гликолиз

В процесс гликолиза включаются активированные формы моносахаридов – гексоз, которые подвергаются окислительному распаду с образованием пировиноградной кислоты. Большой вклад в раскрытие механизмов этих реакций внесли известные биохимики Г. Эмбден, О.Ф. Мейергоф и Я.О. Парнас. Гликолиз представляет собой анаэробную стадию дыхания у высших организмов и основной механизм дыхания у анаэробных микроорганизмов. Реакции гликолиза локализованы в жидкой фазе цитоплазмы и хлоропластов. Ферменты, катализирующие эти реакции в цитоплазме, образуют комплексы с актиновыми белками цитоплазматических филаментов и таким образом обеспечивается локализация происходящих превращений.

Активирование гексоз осуществляется путём фосфорилирования с участием АТФ под действием соответствующих киназ и образующиеся фосфаты гексоз изомеризируются во фруктозо-6-фосфат, который уже далее включается в реакции гликолиза. В первой реакции фруктозо-6-фосфат подвергается повторному фосфорилированию под действием фермента фосфофруктокиназы:

(1)

+ АТФ  + АДФ

фруктозо-6-фосфат фруктозо-1,6-дифосфат

Образующийся в этой реакции фруктозо-1,6-дифосфат имеет полярную молекулу, которая легко подвергается расщеплению на следующем этапе превращений.

Фермент фосфофруктокиназа – аллостерический и поэтому подвержен активной регуляции. Его активность ингибируется высокой концентрацией АТФ и лимонной кислоты, образующейся в цикле Кребса. Однако фермент аллостерически активируется АДФ. Следовательно, при высокой обеспеченности клетки энергией, повышающей концентрацию АТФ, происходит замедление первой реакции гликолиза и в целом интенсивности дыхания. А когда энергетический потенциал клетки понижается и возрастает концентрация АДФ, последний аллостерически активирует фермент фосфофруктокиназу, вследствие чего возрастает скорость включения фрутозо-6-фосфата в реакции гликолиза, вызывая повышение интенсивности дыхания, обеспечивающего клетку энергией.

На следующем этапе гликолиза под действием фермента альдолазы происходит расщепление фруктозо-1,6-дифосфата на две триозы – 3-фос-фоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон:

СН₂О Р СН₂О Р (2) | |

СНОН + С=О

 | |

С=О СН₂ОН

Н

фруктозо-1,6-дифосфат 3-фосфоглицери- фосфодиоксиацетон новый альдегид

(

Между триозофосфатами устанавливается динамическое равновесие с участием фермента триозофосфатизомеразы:

СН₂О Р СН₂О Р (3)

| |

СНОН  С=О

| |

С=О СН₂ОН

Н фосфодиокиацетон

3-фосфоглице-

риновый альдегид

Образовавшийся 3-фосфоглицериновый альдегид далее окисляется в 3-фосфоглицериновую кислоту под действием фермента глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы (1.2.1.12), молекулы которого состоят из четырёх полипептидных субъединиц с молекулярными массами по 45000 и содержат в активном центре тиоловые группы (-SН) и окисленные динуклеотидные группировки НАД⁺. При взаимодействии фермента с 3-фосфоглицери-новым альдегидом образуется фермент-субстратный комплекс, в котором инициирутся возникновение ацилмеркаптановой макроэргичесой связи и восстановление динуклеотидной группировки НАД⁺ в НАДН:

СН₂О Р СН₂О Р (4)

| |

СНОН + НS–фермент + НАД⁺  СНОН + НАДН + Н⁺

| |

С=О С=О

Н S-фермент

3-фосфороглице- фермент-субстратный

риновый альдегид комплекс

П

СН₂О Р СН₂О Р (5)

| |

СНОН + Н₃РО₄  СНОН + НS- фермент

| |

С~S-фермент С=О

О О Р

фермент-суб- 1,3-дифосфоглице-

стратный комплекс риновая кислота

осле этого фермент-субстратный комплекс подвергается фосфоролизу с участием неорганического ортофосфата. При этом НS-фермент отщепляется от субстрата и к остатку субстрата присоединяется фосфатная группировка, в которой за счёт энергии ацилмеркаптановой связи возникает макроэргическая ацилфосфатная связь:

В

СН₂О Р СН₂О Р (6) | |

СНОН + АДФ  СНОН + АТФ

| |

С=О С=О

О Р ОН

1,3-дифосфоглице- 3-фосфогицериновая

риновая кислота кислота

следующей реакции остаток фосфорной кислоты с макроэргической связью переносится на АДФ, в результате чего осуществляется синтез АТФ. Эту реакцию катализирует фермент фосфоглицераткиназа (2.7.2.3):

Так как в реакции (5) макроэргическая ацилфосфатная связь возникает в составе субстрата, такой процесс называют субстратным фосфорилированием.

Полученная в реакции (6) 3-фосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфоглицератмутазы изомеризуется затем в 2-фосфо-глицериновую кислоту:

СН₂О Р СН₂ОН (7) | |

СНОН  СНО Р

| |

С=О С=О

ОН ОН

3-фосфоглице- 2-фосфоглице-

риновая кислота риновая кислота

П

СН₂ОН СН₂ (8)

| ||

СНО Р  СО Р + Н₂О

| |

С= О С=О

\ \

ОН ОН

2-фосфоглице- фосфоенолпиро-

риновая кислота виноградная кислота

осле этого от 2-фосфоглицериновой кислоты отщепляется молекула воды с образованием фосфоенолпировиноградной кислоты. Реакцию дегидратации катализирует фермент енолаза (4.2.1.11):

В результате дегидратации в молекуле субстрата происходит перераспределение внутренней энергии и возникает макроэргическая связь.

О

СН₂ СН₂ (9)

|| ||

СО Р + АДФ  С-ОН + АТФ

| |

С=О С=О

ОН ОН

фосфоенолпиро- енолпировино-

виноградная кислота градная кислота

т молекулы фосфоенолпировиноградной кислоты фосфатная группировка с макроэргической связью передается на АДФ, в результате чего осуществляется синтез АТФ. Перенос фосфатной группировки в этой реакции катализирует фермент пируваткиназа (2.7.1.40):

Пируваткиназа аллостерически ингибируется высокой концентрацией АТФ и ацетилкофермента А, который образуется при дальнейшем превращении пировиноградной кислоты в ходе дыхательных реакций.

Продукт реакции (9) енолпировиноградная кислота самопроизвольно подвергается перегруппировке и превращается в более устойчивую кетоформу – пировиноградную кислоту.

СН₂ СН₃ (10)

|| |

С-ОН  С=О

| |

С=О С=О

ОН ОН

енолпировино- пировиноградная

градная кислота кислота

Учитывая, что из гексозы образуется 2 триозы, в ходе их окисления возникают 2 молекулы пировиноградной кислоты. По этой же причине все реакции гликолиза, начиная с четвертой, при окислении одной молекулы гексозы повторяются дважды. В ходе гликолиза, кроме двух молекул пировиноградной кислоты, синтезируются биоэнергетические продукты в виде четырёх молекул АТФ (в реакциях 6 и 9) и двух молекул НАДН (в реакции 4). В связи с тем, что на активирование гексозы затрачивается 2 молекулы АТФ, то окончательный выход АТФ при гликолизе составляет не 4, а 2 молекулы. Кроме того, в реакции 9 происходит дегидратация 2-фосфоглицериновой кислоты, поэтому в расчете на 1 молекулу окисляемой гексозы выделяется 2 молекулы воды. Исходя из этих данных, суммарное уравнение гликолиза принимает следующий вид:

С₆Н₁₂О₆+2НАД⁺+2Н₃РО₄+2АДФ  2СН₃–СО–СООН+2НАДН+2Н⁺+ 2АТФ+2Н₂О

гексоза пировиноградная

кислота

Конечный продукт гликолиза – пировиноградная кислота представляет собой один из важнейших продуктов дыхания и в целом обмена веществ любого организма. У анаэробных организмов пировиноградная кислота включается в реакции брожения, в ходе которых в зависимости от организма происходит синтез этилового спирта, молочной, уксусной, пропионовой кислоты и некоторых других биохимических продуктов. У растений и других аэробных организмов пировиноградная кислота подвергается окислению до СО₂ и Н₂О в ходе реакций цикла Кребса. В некоторых органах растений при недостатке кислорода также могут частично происходить реакции брожения, конечным продуктом которых чаще всего является этиловый спирт.

Через образование пировиноградной кислоты, как будет показано далее, осуществляется связь между обменом углеводов, липидов и белков в растительном организме. Из пировиноградной кислоты путём аминирования синтезируется аминокислота аланин, которая участвует в реакциях азотного обмена и синтезе белков. Путём превращения в ацетил-КоА пировиноградная кислота даёт начало синтезу жирных кислот. А с другой стороны, при распаде белков, аминокислот, жирных кислот на определённых этапах образуется пировиноградная кислота, которая может использоваться на синтез углеводов путём обращения реакций гликолиза благодаря тому, что большинство ферментов, катализирующих эти реакции, обладают обратимым действием. Однако некоторые стадии гликолиза необратимы и для их преодоления используются обходные пути.

Первый необратимый этап в ходе превращения пировиноградной кислоты в гексозу – это образование из пировиноградной фосфоенолпирови-

н

СН₃ СН₂-СООН

| |

С=О + СО₂ + Н₂О + АТФ  С=О + АДФ + Н₃РО₄

| |

СООН СООН

пировино- щавелевоуксусная

градная кислота кислота

оградной кислоты. Он осуществляется в четыре последовательные реакции, происходящие в митохондриях и цитоплазме. Вначале пировиноградная кислота карбоксилируется с участием АТФ под действием митохондриальной пируваткарбоксилазы (6.4.1.1) и превращается в щавелевоуксусную кислоту:

З

СН₂-СООН СН₂-СООН

| |

С=О + НАДН + Н⁺  СНОН + НАД⁺

| |

СООН СООН

щавелевоук- яблочная

сусная кислота кислота

атем щавелевоуксусная кислота восстанавливается митохондриальной малатдегидрогеназой в яблочную кислоту:

О

СН₂-СООН СН₂-СООН

| |

СНОН + НАД⁺  С=О + НАДН + Н⁺

| |

СООН СООН

яблочная щавелевоук-

кислота сусная кислота

бразовавшаяся яблочная кислота перемещается в цитоплазму и под действием цитоплазматической малатдегидрогеназы снова превращается в щавелевоуксусную кислоту:

П

СН₂-СООН СН₂

| ||

С=О + ГТФ  СО Р + СО₂ + ГДФ

| (или АТФ) |

СООН СООН

щвелевоуксус- фосфоенолпиро-

ая кислота виноградная кислота

осле этого под действием фермента фосфопируваткарбоксикиназы (4.1.1.32) из щавелевоуксусной кислоты путём декарбоксилирования образуется фосфоенолпировиноградная кислота:

П

ревращение фосфоенолпировиноградной кислоты в 3-фосфо-глицериновый альдегид осуществляется в результате обращения соответствующих реакций гликолиза (8-4). В ходе этих реакций на фосфорилирование 3-фосфоглицериновой кислоты затрачивается АТФ, а на восстановление фермент-субстратного комплекса глицеральдегидфосфатдегидрогеназы – восстановленные динуклеотиды НАДН.

В результате обращения реакций гликолиза 3 и 2 происходит синтез фруктозо-1,6-дифосфата из 3-фосфоглицеринового альдегида. А под действием фруктозо-1,6-дифосфатазы фруктозодифосфат гидролизуется с образованием фруктозо-6-фосфата, с превращения которого начинаются реакции гликолиза:

+ Н₂О  + Н₃РО₄

фруктозо-1,6-дифосфат фруктозо-6-фосфат

Реакции гликолитического окисления фруктозо-6-фосфата до пировиноградной кислоты и обратный процесс синтеза фруктозо-6-фосфата из пировиноградной кислоты могут быть представлены в виде следующей схемы (рис. 36).

Реакции гликолиза являются важным источником биоэнергетических продуктов для функционирующей клетки, таких как АТФ и НАДН, а также промежуточных метаболитов, которые могут использоваться для синтеза многих жизненно важных веществ. К ним относятся 3-фосфоглице-риновый альдегид и фосфодиоксиацетон, 3-фосфоглицериновая кислота, фосфоенолпировиноградная кислота. Фосфоглицериновый альдегид, кроме реакций гдиколиза, является также промежуточным продуктом пентозо-фосфатного цикла и через него осуществляется связь между этими двумя важнейшими биохимическими поцессами, происходящими в цитоплазме растительных клеток.

Фосфодиоксиацетон при его восстановлении превращается в глицеролфосфат, который даёт начало реакциям синтеза ацилглицеринов, фосфолипидов и гликолипидов. Из 3-фосфоглицериновой кислоты образуется оксипировиноградная кислота и аминокислота серин. Фосфоенолпировиноградная кислота необходима для синтеза щавелевоуксусной кислоты и фенольных соединений.