Бактерии, минерализующие соединения фосфора. Метод учета микроорганизмов, растворяющих ортофосфат кальция.

Цели занятия:

- выделить фосфатрастворяющие микроорганизмы чашечным методом из почвенного образца;

- изучить морфологию фосфатрастворяющих микроорганизмов.

Вопросы для самоконтроля:

1. Основные части микроскопа, их назначение и устройство.

2. Техника приготовления препарата «раздавленная капля».

3. Круговорот фосфора в природе.

4. Макро-, микро- и ультромикроэлементы.

5. Функции фосфора в растительной клетке.

Вводная часть:

Фосфор содержится в почве, как правило, в виде труднодоступных минеральных и органических соединений, которые становятся доступными для растений только после их минерализации микроорганизмами. Минеральные вещества представлены главным образом ортофосфатами кальция (нейтральные и щелочные почвы), железа и алюминия (кислые почвы). Органические соединения фосфора встречаются в виде инозитфосфатов, фосфорсодержащих белков, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и др. Около половины органического фосфора почвы содержится в наиболее устойчивых к действию микроорганизмов фосфатах инозита (фитатах). Особенно широко распространен инозитолгексофосфат (фитин). Микроорганизмы, синтезирующие фосфатазу, способны отщеплять от органических фосфатов фосфорную кислоту, которая, взаимодействуя с катионами, переходит в соли фосфорной кислоты, доступные для растений.

В почве не обнаружены специфические микроорганизмы, растворяющие ортофосфаты кальция, железа и алюминия. В этом процессе бактерии участвуют лишь косвенно. Так, многие микроорганизмы в процессе дыхания выделяют углекислоту, нитрифицирующие бактерии, окисляя аммоний, образуют азотистую и азотную кислоты, серобактерии, окисляя сероводород и серу, продуцируют серную кислоту. Эти кислоты взаимодействуют с фосфатами и образуют кислые соли, доступные растениям:

Ca₃(PO₄)₂ + 2CO₂ + 2H₂O = 2CaHPO₄ + Ca(HCO₃)₂;

Ca₃(PO₄)₂ + 2H₂SO₄ = Ca(H₂PO₄)₂ + 2CaSO₄;

Ca₃(PO₄)₂ + 4HNO₃ = Ca(H₂PO₄)₂ + 2Ca(NO₃)₂.

Сходным образом действуют на фосфаты и бактерии, образующие органические кислоты в процессе ассимиляции углеводов.

Одним из самых удобных методов выделения фосфатрастворяющих микроорганизмов является чашечный, когда активные микроорганизмы отбирают из колоний на агаровой пластинке в зонах растворения фосфатов. Эти зоны формируются четкими в случае, когда среда достаточно и равномерно мутна, а количество нерастворимого фосфата в ней сравнительно невелико. Поэтому наилучший эффект дает внесение в среду свежеосажденных солей.

Для выделения из почвы бактерий, растворяющих ортофосфаты кальция, используют глюкозоаспарагиновую среду Муромцева состава (г/л): глюкоза – 10; аспарагин – 1; K₂SO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; агар-агар – 20; кукурузный экстракт – 0,02; вода водопроводная; рН 6,8. Стерилизация при 0,5 ати 25 мин.

Фосфаты кальция Ca₃(PO₄)₂ вносят в питательную среду методом осаждения. Для этого в стерильную расплавленную агаризованную среду вносят (из расчета на 1 л) 3,4 г CaCl₂*6H₂O, а после его растворения добавляют 3,8 г Na₃PO₄*12H₂O. Соли вносят в сухом виде, что позволяет избежать быстрого гидролиза Na₃PO₄ в растворе и обеспечивает постепенное взаимодействие CaCl₂*6H₂O и Na₃PO₄ по мере их растворения. На 1 л среды образуется 1,5 г свежеосажденного Ca₃(PO₄)₂. Приготовленную таким образом питательную среду разливают в чашки Петри.

Материалы и оборудование:

Стерильные пробирки, стерильные фарфоровые чашечки, резиновые перчатки, чашки Петри с питательной средой Муромцева, микроскопы, предметные и покровные стекла, спиртовки, петли бактериологические, стерильные пипетки и шпателя, физ. раствор.

Задание:

Выделить фосфатрастворяющие микроорганизмы чашечным методом из почвенного образца. Описать морфологию их колоний. Описать морфологическое разнообразие клеток выросших микроорганизмов. Приготовить препарат «раздавленная капля». Микроскопировать с объективом 40х.

Ход работы:

Образцы почвы помещаем в стерильные пробирки, непосредственно на месте их отбора. Для разрушения почвенных агрегатов используем метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 минут в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.

Приготовленную питательную среду разливают в чашки Петри, и после застывания агара засевают поверхностно 0,1 мл почвенной суспензии из разведений 10^-4 – 10^-7, которые готовят из 1 г почвы и 100 мл стерильной водопроводной воды (разведение 10^-2). Чашки инкубируют при 28-30^оС в течение 3-9 суток. По образованию зон просветления вокруг колоний активных микроорганизмов судят о растворении фосфата кальция.

Из зон разрушения фосфата кальция готовят препарат «раздавленная капля» и описывают выделенные различные фосфатрастворяющие микроорганизмы.

Отчет по лабораторной работе должен содержать:

1. Название и цели работы.

2. Основные этапы работы.

3. Описание морфологии колоний фосфатрастворяющих бактерий.

4.Зарисовку микропрепарата «раздавленная капля» фосфатрастворяющих бактерий.