3. Связывание рубомицина и доксорубицина с эритроцитами пациентов.

Было исследовано связывание рубомицина и доксорубицина с эритроцитами здоровых доноров и пациентов. Эти исследования проводились в цельной крови и в суспензии отмытых клеток. Для этого к цельной крови или суспензии эритроцитов добавлялся раствор рубомицина или доксорубицина, после чего смесь инкубировали при перемешивании в течение трех часов при 37^оС. Для отмывки и инкубации отмытых эритроцитов использовался изотонический буферный раствор PBS. Во время инкубации отбирались образцы для определения концентрации препарата в пробе и во внеклеточной среде (для отделения клеток образцы центрифугировались 10 минут при 1000 g). Концентрация рубомицина в эритроцитах рассчитывалась на основании данных о его концентрации в крови (в суспензии) и во внеклеточной среде по формуле:

Ce = (Co – Cm(1 – Ht))/Ht

где

Ce - концентрация антибиотика в эритроцитах,

Co – концентрация антибиотика в крови (в суспензии),

Cm - концентрация антибиотика в среде,

Ht – значение гематокрита крови (суспензии).

Рубомицин и доксорубицин из образцов экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃ и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация препарата в хлороформных экстрактах определялась спектрофотометрически по поглощению света на длине волны 486 нм для рубомицина и 500 нм для доксорубицина (точность измерения 5%). Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации.

Отдельно было проверено возможное связывание рубомицина с полимерным контейнером, а также изучена кинетика связывания эритроцитов с рубомицином в полимерном контейнере (связывание эритроцитов с доксорубицином в полимерном контейнере было исследовано ранее в нашей лаборатории). Для проверки возможного связывания рубомицина с полимерным контейнером в контейнер помещался раствор рубомицина с концентрацией 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл и 5,0 мг/мл и инкубировался при 37^оС. В течение инкубации из контейнера отбирались образцы для определения концентрации рубомицина в растворе. Для изучении кинетики связывания эритроцитов с рубомицином в контейнере полимерный контейнер, содержащий консервированную эритроцитарную массу, предварительно термостатировался в водном термостате 1 час, после чего в него вводили 70 мл физиологического раствора, содержащего 100 мг рубомицина, и полученная суспензия инкубировалась 1 час при 37 градусах. В течение инкубации из полимерного контейнера отбирались образцы суспензии, для определения содержания рубомицина в среде. Определялся гематокрит исходной массы и полученной суспензии.

4. Повреждающее воздействие рубомицина и доксорубицина на эритроциты человека.

Исследования повреждающего воздействия рубомицина и доксорубицина на эритроциты проводилось на донорских эритроцитах, выделенных из консервированной эритроцитарной массы , заготовленной на стандартном гемоконсерванте «Глюгицир». Эритроцитарную массу центрифугировали 10 минут при 1000 g и удаляли плазму и верхний слой клеток, содержащий лейкоциты и тромбоциты. После этого эритроциты трижды отмывали путем ресуспендирования в 3 кратном объеме изотонического забуференного раствора PBS (NaCl - 140mM, Na₂HPO₄ - 9mM, NaH₂PO₄ - 1.3mM, глюкоза 5mM, pH=7,4) с последующим центрифугированием 10 минут при 1000 g и удалением надосадка. Отмытые эритроциты ресуспендировались в PBS, содержащем необходимое количество антибиотика, до значения гематокрита 40-50% и суспензия инкубировалась при постоянной температуре и перемешивании до 8 часов (гематокрит суспензии (Ht) – отношение объема клеток в суспензии ко всему объему суспензии). В качестве контроля использовались эритроциты, инкубируемые в растворе PBS, не содержащем антибиотик. Для инкубации эритроцитов с доксорубицином pH инкубационного раствора снижался до значения 7,0, поскольку при больших значениях pH доксорубицин плохо растворим.

Для определения выхода гемоглобина и К⁺ из эритроцитов образцы суспензии центрифугировались 10 минут при 1000g. Концентрацию гемоглобина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре гемоглобина при длине волны 415 нм. Общее содержание гемоглобина в суспензии определяли по высоте пика при 415 нм в спектре водного лизата суспензии. Относительный выход гемоглобина (в %) определяли как отношение высот пиков при 415 нм в спектрах надосадочного раствора и водного лизата. Концентрацию К⁺ в надосадках и в водных лизатах суспензии определяли на пламенном фотометре.

Подсчет числа клеток в суспензии и определение их объема производилось кондуктометрическим методом [Руденко 1995] с помощью прибора “Coulter-Counter” (Франция).

Деформируемость эритроцитов оценивали по их фильтруемости (способности проходить по порам) путем измерения скорости протекания суспензии клеток через мембранные фильтры с цилиндрическими порами при давлении 60 мм водного столба с помощью прибора ИДА-01, представляющего собой модификацию гемореометра Хансса [Аттаул 1994 «Анализ, Лисов 1994]. Перед измерением фильтруемости эритроцитов из образцов инкубируемой суспензии отбирали пробы, эритроциты трижды отмывали раствором PBS и разбавляли раствором PBS до значения гематокрита 1 % или 0,5 %. В некоторых экспериментах суспензия эритроцитов разбавлялась раствором PBS до гематокрита 0,1 % без трехкратной отмывки. Для каждого фильтра определяли время протекания 250 мкл ресуспендирующего раствора (Tb) и суспензии эритроцитов (Ts). Для характеристики деформируемости эритроцитов использовали отношение этих времен (Tb/Ts). В работе использовали фильтры толщиной 9 мкм с диаметром пор 3 мкм. Измерения проводили при комнатной температуре (21^оС). Погрешность измерения (Тb/Ts) составляла около 10%.

Концентрацию ATP в эритроцитах определяли модифицированным люциферин-люциферазным методом [Атауллаханов 1981].

Также было исследовано влияние рубомицина на деформируемость и электрофоретическую подвижность (ЭФП) эритроцитов больных острыми лейкозами (ОЛ) при инкубации эритроцитов больных с раствором антибиотика в цельной крови больного. Деформируемость эритроцитов больных оценивали так же, как и деформируемость донорских эритроцитов, для характеристики деформируемости использовали отношение времен (Tb/Ts). ЭФП эритроцитов как характеристика электрического заряда поверхности эритроцитов определялась по скорости перемещения отдельных клеток в электрическом поле по формуле:

ЭФП=Р/(ЕТ),

где Е – напряженность электрического поля (вольт/см),

Р – расстояние, пройденное клеткой, определенное с помощью светового микроскопа (мкм),

Т – время прохождения клеткой расстояния Р (с).

Для получения достоверных результатов определялась ЭФП для 20 разных эритроцитов, вычислялось среднее значение и стандартное отклонение. Подробно методика определения ЭФП эритроцитов описана в [Козинец 1986].