Материалы и методы

1. Используемые лекарственные препараты и химические реактивы

В работе для клинических исследований использовался фармацевтический препарат рубомицина - рубомицина гидрохлорид (ФАО «Ферейн», Россия); фармацевтические препараты доксорубицина - доксорубицина гидрохлорид (ФАО «Ферейн», Россия), адриабластин («Farmitalia», Италия), адриабластин («Pharmacia&Upjohn», Италия), растоцин (АО «Плива», Хорватия); фармацевтический препарат винкристина – винкристина сульфат («Pierre fabre», Франция); липосомольная форма рубомицина – DaunoXome («NeXstar», США); фармацевтический прапарат эремомицина – эремомицина сульфат, любезно предоставленный Институтом по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Для отбора аутокрови у пациентов использовались стандартные пластиковые контейнеры «Гемакон» (Россия), содержащий 100 мл гемоконсерванта «Глюгицир» (натрия гидроцитрата двузамещенного - 20 г, глюкозы - 30 г, воды для инъекций – до 1 л), или пластиковые контейнеры фирмы Baxter, содержащий 63 мл гемоконсерванта CPDA-1 (декстрозы – 2 г, натрия гидроцитрата - 1,66 г, лимонной кислоты - 206 мг, натрия монофосфата – 140 мг, аденина – 17,3 мг).

Для экспериментов in vitro использовались химические реактивы, производства «Реахим», чистота – «осч» или «чда»

2. Методики определения антрациклиновых антибиотиков в биологических жидкостях (кровь, плазма, костный мозг, ликвор, амниотическая жидкость).

Для определения рубомицина и доксорубицина в крови и плазме крови использовался спектрофлюориметрический метод, описанный в [Атауллаханов 1998, Куликова 1998 ]. Рубомицин и доксорубицин из образцов экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃ и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация рубомицина и доксорубицина определялась спектрофлюорометрически по излучению на длине волны 600 нм (для рубомицина) и 588 нм (для доксорубицина) при длине волны возбуждения 476 нм. Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации. В работе использовались спектрофлюориметры Jobin Yvon Spectrofluo JY3 D (Франция) и Shimadzu (Япония). Минимальная концентрация препарата, которую позволяет определить спектрофлюориметрический метод в пробах крови и плазмы, составляла 20 нг/мл для Jobin Yvon Spectrofluo JY3 D и 10 нг/мл для Shimadzu RF-5000.

Для разработки методики определения рубомицина и доксорубицина в костном мозге, ликворе и амниотической жидкости предварительно была исследована возможность хлороформной экстракции рубомицина и доксорубицина из образцов костного мозга, ликвора и амниотической жидкости. Для этого к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃, после этого – 3.0 мл, 5.0 мл или 10.0 мл хлороформа. Далее смесь интенсивно встряхивалась. Показано, что из образцов ликвора и амниотической жидкости полная экстракция осуществима при добавлении 3 мл хлороформа. Из образцов костного мозга полной экстракции добиться не удалось (только 70-80%).

Также была исследована возможность точного количественного определения рубомицина и доксорубицина, экстрагированного из образцов ликвора и амниотической жидкости. Для этого спекторфлюориметрически определенная (заранее известная) концентрация рубомицина и доксорубицина, экстрагированного из образцов, сравнивалась с калибровочной прямой, построенной с использованием хлороформных экстрактов растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации в воде. Установлено соответствие.

Из проделанной работы следует, что методика определения рубомицина и доксорубицина в образцах ликвора и амниотической жидкости не отличается от таковой для крови и плазмы.

Для определения рубомицина и доксорубицина в образцах костного мозга предлагается использовать ту же методику, что и для образцов крови и плазмы, только в качестве калибровки использовать хлороформные экстракты из калибровочных образцов костного мозга. Для этого несколько образцов костного мозга, не содержащего антрациклины, следует смешать с раствором рубомицина или доксорубицина (в зависимости от того, концентрацию какого антибиотика нужно определить в костном мозге) известной концентрации. Суспензии инкубировать при 37^оС в течение 0,5 – 1,0 часа при перемешивании. Таким образом приготовятся калибровочные образцы костного мозга, содержащие известную концентрацию антибиотика.

Отдельно установлено, что образцы костного мозга, ликвора и амниотической жидкости можно хранить в замороженном виде при температуре (–15^оС) – (- 20^оС) без потери спектрофлюориметрических характеристик рубомицина или доксорубицина не менее 3 месяцев.