2 Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов

Способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами.

Распространенный способ заполнения эритроцитов лекарственными веществами - обратимый осмотический лизис. Отмытые от плазмы эритроциты помещают в гипотонический раствор (с тоничностью порядка десятков осмолей), содержащим препарат, который необходимо ввести в эритроциты. Во время этой процедуры увеличивается объем эритроцитов и образовываются разрывы в мембранах эритроцитов, через которые препарат и попадает внутрь эритроцитов. Далее эритроциты запечатывают, восстанавливая тоничность раствора добавлением необходимого количества NaCl. После этой процедуры часть препарата остается внутри эритроцитов. Далее эритроциты с препаратом внутри инкубируют некоторое время при 37C. При использовании этого метода удается ввести в эритроциты только около 10-20% препарата из раствора. Данный метод приводит к большим потерям эритроцитов из-за необратимого лизиса, что является следствием достаточно быстрого и грубого воздействия на клетки. Не разрушившиеся эритроциты бывают сильно повреждены и иногда не обладают достаточно большим временем жизни в организме. Кроме того, метод требует расхода дорогих препаратов, так как в процессе заполнения необходимо сильное разбавление исходного объема эритроцитов лизирующим раствором, содержащим препарат, большая часть которого остается неиспользованным [Ihler 1973].

Более мягким методом заполнения эритроцитов некоторыми препаратами является мето, при котором лизис эритроцитов происходит не сразу, а постепенно [Alpar 1985, Pitt 1983]. Добавление к эритроцитам гипотонического раствора, содержащего лекарственный препарат, в этом случае производят не сразу, а небольшими порциями до достижения "точки лизиса" клеток, при этом необходимо отмывать эритроциты перед каждой заменой среды. Далее эритроциты «запечатывают» путем инкубации в среде с нормальной тоничностью. Таким способом удается ввести в эритроциты около 25% препарата из раствора. Эритроциты, полученные данным методом, имеют хорошую приживаемость в организме, однако, большое число отмывок (с центрифугированием) все же повреждает клетки.

Известен метод включения веществ в эритроциты путем высоковольтного диэлектрического пробоя мембраны [Serpersu 1985, Zimmermann 1976] с образованием в эритоцитарной мембране пор. Оптимальными условиями этого процесса являются: продолжительность воздействия 20 микросекунд и напряжение 1-2 kV см^-1. Данный метод дает хорошие по качеству эритроциты, однако он широко не используется из-за его трудоемкости и из-за того, что позволяет получать незначительное количество наполненных эритроцитов.

Существует также диализный метод [DeLoach 1977, 1991 BAB, Tonetti 1990]. Согласно этому методу отмытые эритроциты помещают в диализный мешок, куда добавляется небольшое количество концентрированного запечатываемого вещества в изоосмотическом растворе. Диализ ведут два часа при комнатной температуре, гематокрите суспензии 70-80 %, против гипоосмотического внешнего раствора при постоянном перемешивании. Таким образом, изменение тоничности внутри диализного мешка происходит постепенно. После завершения диализа против гипоосмотического раствора, во внешней среде восстанавливается тоничность и запечатывают эритроциты, инкубируя их в изоосмотической среде при температуре 37^оС. Метод позволяет получать высокую концентрацию вещества внутри эритроцитов и позволяет ввести в эритроциты 40-50% препарата. Недостатком данного метода является: достаточно быстрое снижение тоничности внутри диализного мешка из-за высокого градиента в концентрациях солей снаружи и внутри мешка, из-за использования в качестве гипоосмотического раствора дистилированную воду или 5 mM фосфатный буфер. Это приводит к быстрому раскрытию эритроцитов,что может повреждать их. Более хорошую приживаемость в русле крови показывают эритроциты, полученные методом ступенчатого диализа [Sinauridze 1992,Perez 1999]. Он отличается от метода простого диализа тем, что тоничность гипоосмотического раствора снижается ступенями. Отмытые эритроциты смешиваются с высококонцентрированным раствором вводимого препарата и помещаются в диализный мешок, после чего начинают диализ против гипоосмотического раствора. Через 15-20 минут во внешний диализирующий раствор добавляют дистиллированную воду, таким образом диализ проводится в более мягких условиях, эритроциты набухают постепенно, с медленным достижением "точки лизиса". При этом методе эритроциты меньше травмируются, после введения in vivo они дольше циркулируют в кровотоке. При использовании этого метода удается ввести в эритроциты 50-55 % от исходного количества препарата. Преимущества этого метода – малые потери как препарата, так и эритроцитов в процессе приготовления эритроцитов-переносчиков. Ограничения – возможность включения только высокомолекулярных веществ.

Для увеличения проницаемости мембран эритроцитов для нагружаемого препарата иногда в дополнение к основным методикам заполнения эритроцитов используют Амфотерицин В [Kitao 1978, 1980 ]. Описан метод регистрации АТФ в эритроцитах с помощью введенной в клетки люциферазы [Атауллаханов 1981].

В некоторых исследованиях в качестве модификаций существующих методик мембраны заполненных препаратом эритроцитов специально обрабатывались антителами для лучшего их распознавания макрофагами [Magnani 1997, Chiarantini 1992].

Для некоторых препаратов перспективным методом является метод прямой инкубации эритроцитов в среде, содержащей данный препарат. Было обнаружено, что эритроциты человека, а также мышиные и собачьи эритроциты при инкубации в растворе рубомицина или доксорубицина могут связывать антибиотик непосредственно из инкубационной среды [Атауллаханов 1993, Tonetti 1990, DeLoach 1985 J Appl Bioch]. Так, эритроциты мышей связывают 80 – 90% добавленного в суспензию рубомицина при температуре 21^оС и гематокрите суспензии 30%. С ростом начальной концентрации рубомицина в среде от 0,3 до 2,5 мг/мл абсолютная скорость связывания рубомицина растет, а относительная – падает. При этом связывание происходит за 5 – 30 минут [Атауллаханов 1993]. Показано, как на связывание рубомицина и доксорубицина эритроцитами человека влияет температура, концентрация антибиотика и гематокрит суспензии [Атауллаханов 1994, Ataullakhanov 1994]. Установлено, что оптимальными условиями для связывания антрациклиновых антибиотиков эритроцитами человека в инкубационной среде являются pH = 7,4 и температура 37^оС.

Однако процесс инкубации рубомицина с эритроцитами сопровождается выходом Hb из эритроцитов, что указывает на повреждающее воздействие антрациклиновых антибиотиков на эритроциты [Атауллаханов 1993].

Исследован способ иммобилизации препаратов в эритроцитах путем обработки глютаровым альдегидом эритроцитов, заполненных различными препаратами [DeLoach 1977]. Этот способ используется также как один из методов обеспечения направленного транспорта инкапсулированного препарата в селезенку и печень: обработанные клетки распознаются в качестве поврежденных и удаляются в печени и селезенке [DeLoach 1977]. Также такая обработка помогает предотвратить быстрый выход инкапсулированного вещества из эритроцитов, а также дольше сохраняет целостность эритроцитов [Атауллаханов 1993], однако, делая их менее деформируемыми [Lisovskaya 1998], т.к. глютаральдегид образовывает ковалентные связи с белками мембраны, а также инактивирует некоторые метаболические системы в эритроцитах [Gaudreault 1989, Tonetti 1990]. Исследовалась обработка глютаровым альдегидом эритроцитов, нагруженных рубомицином [Gaudreault 1989, Атауллаханов 1993], доксорубицином [Tonetti 1990], метатрексатом [DeLoach 1983].

Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов.

Эритроциты можно использовать как биологические носители для различных типов лекарственных препаратов. Введение больным лекарственного соединения в эритроцитах-переносчиках позволяет поддерживать концентрацию этого препарата в крови на постоянном уровне или за счет диффузии препарата из клеток, или за счет постепенного разрушения эритроцитов-переносчиков в кровяном русле [Gregoriadis 1977, Sprandel 1979].

Возможность коррекции метаболизма с помощью эритроцитов-переносчиков показана в работах [Sprandel 1985, Fazi 1994, Rossi 1992]. В опытах in vitro доказана способность к окислению метанола эритроцитами, нагруженными алкогольоксидазой. В опытах in vivo у мышей, получавших такие эритроциты, отмечался половинный уровень метанола в крови в сравнении с контрольной группой, получавшей ненагруженные эритроциты. Исследование показывает возможность с помощью эритроцитов-носителей снижать токсический эффект метанола [Fazi 1994].

Исследована способность человеческих и мышиных эритроцитов с инкапсулированной глюкооксидазой регулировать потребление глюкозы в опытах in vitro. В опытах на мышах показано, что эритроциты, нагруженные глюкооксидазой и гексокиназой способны регулировать уровень глюкозы в крови в пределах физиологических значений [Rossi 1992].

Антидот цианидов тиосульфат натрия и его катализатор бычья роданеаза были инкапсулированы в мышиные эритроциты. Они эффективно использовались для предотвращения летальных эффектов, вызванных цианидами у мышей [Cannon 1994, Petrikovics 1994].

Продемонстрирована возможность регулирования уровня мочевой кислоты при помощи уратооксидазы, инкапсулированной в эритроциты [Sprandel 1985].

Фермент глютамат дегидрогеназа, заключенный в эритроциты, эффективен in vitro и in vivo на мышах для быстрого снижения высоких уровней аммония в кровотоке [Sanz 1999].

Для профилактики и снятия органофосфорной интоксикации принципиально возможно использовать эритроциты-переносчики рекомбинантной фосфотриэстеразы. Показана эффективность такого препарата in vitro [Pei 1994].

Описана попытка методом обратимого осмотического лизиса инкапсулировать в эритроциты противоопухолевый препарат карбоплатину. Был достигнут высокий процент включаемости препарата в эритроциты и сохранности эритроцитов при инкапсулировании препарата, наблюдался медленный выход препарата из эритроцитов, однако внутри эритроцитов препарат включался в метаболизм и быстро инактивировался, преобразовываясь в свои метаболиты [Tonetti 1992].

В работе [Атауллаханов 1985] исследовалась проницаемость человеческих эритроцитов для аспарагина. Аспарагин способен проникать в человеческие эритроциты из внешней среды, и заполнение эритроцитов аспарагиназой путем обратимого осмотического лизиса не влияет на их проницаемость для аспарагина. При инкубации таких эритроцитов с аспарагином в них накапливается аспарагиновая кислота, что указывает на быструю переработку проникающего в клетки аспарагина находящейся внутри аспарагиназой. Эритроциты, нагруженные L-аспарагиназой, были получены методом ступенчатого диализа и была исследована фармакокинетика таких эритроцитов на мышах. При введении мышам свободного препарата L-аспарагиназы его концентрация в крови падает до нуля в течение двух суток, при введении инкапсулированного препарата в эритроциты, его концентрация в плазме не снижается до нуля и через 30 суток [Sinauridze 1992]. В других экспериментах L-аспарагиназа, инкапсулированная в эритроциты, вводилась мышам c 6C3HED опухолью. Была показана эффективность препарата и его направленный транспорт в органы ретикулоэнлотелиальной системы [Alpar 1985]. В работах [DeLoach 1990, Naqi 1988] L-аспарагиназа, инкапсулированная в эритроциты методом гипотонического диализа, внутривенно и внутрибрюшинно вводилась собакам. Показана хорошая приживаемость эритроцитов, нагруженных L-аспарагиназой.

Возможно и подкожное введение эритроцитов-переносчиков препаратов, в стандартном виде вызывающих экстравазацию и некрозы тканей [DeLoach 1988 BAB Subcutaneous.]. Специально разработанный микотоксин трикотецеин (Т-2) был инкапсулирован в бычьи эритроциты для снятия его высокой токсичности. Препарат вводился мышам внутрибрюшинно и обнаруживался в терапевтических концентрациях в печени, где ингибировал рост 50% бактерий [DeLoach 1988 BAB Targ].

Собачьи эритроциты, заполненные метотрексатом, обрабатывались глютаровым альдегидом, что обеспечивало направленный транспорт (более 50%) препарата в печень собак [DeLoach 1983, 1981].

Сообщают, что пациентам с болезнью Гаучера вводили глюкоцереброзидазу в эритроцитах [Beutler 1977]. Время полунахождения препарата в кровотоке составляло 10 дней, что значительно превышало этот показательдля свободного препарата. Побочных эффектов не наблюдалось и был получен заметный терапевтический эффект.

Введение мышам гликопротеина В (gB1s) из вируса Herpes simplex (HSV) в аутоэритроцитах для иммунизации предохраняло мышей от летальных эффектов при заражении большими дозами HSV, а также было эффективно против латентной формы HSV-1 [Chiarantini 1997].

Для снятия высокой токсичности, возникающей при введении высоких доз интерлейкина-2, этот препарат вводился с помощью эритроцитов-переносчиков, при этом его биологическая активность сохранялась в экспериментах in vitro и in vivo на мышах [Moyes 1996, Kirch 1994].

Эритроциты, содержащие инозитол гексафосфат вводились мышам, после чего мышей заражали Babesia microti. Процент паразитемии был значительно снижен в 3, 5, 7 дни после инфицирования. Авторы предлагают препарат эритроцитов, нагруженных инозитол гексафосфатом для профилактики заболевания [DeLoach 1988 Res vet].

В мышиные и овечьи эритроциты инкапсулировали рекомбинантный человеческий интерлейкин-2, получали 70% препарата, включенного в эритроциты. Препарат работал in vitro, а в экспериментах in vivo после подкожного введения мышам обнаруживался в тканях даже через три дня после инъекции [DeLoach 1988].

В работе [DeFlora 1988 ] показана возможность инкапсулирования в эритроциты препарата 5-фтор-2-деоксиуридин-5-монофосфата (FdUMP) без повреждающего влияния на метаболизм и морфологию эритроцитов. В эритроцитах происходило дефосфорилирование FdUMP до 5-фтор-2-деоксиуридина (FdUrd), противоопухолевого препарата, медленно выходящего из эритроцитов. Позже были разработаны и синтезированы различные молекулярные комплексы, также являющиеся предшественниками пиримидиновых антиметаболитов, которые инкапсулировались в эритроциты для внутриклеточной наработки FdUrd и 5-фторурацила (FU) [Gasparini 1994 ]. Аналогичные эксперименты были проведены для 2-фтор-ара-АМФ (флюдарабин фосфат), который инкапсулировался в эритроциты. Он не оказывал повреждающего воздействия на метаболизм эритроцитов и дефосфорилировался с помощью клеточных ферментов до флюдарабина, который по мере наработки может свободно выходить через эритроцитарную мембрану [Fraternale 1996]. Теоретически, вышеназванные системы могут служить долго циркулирующими и медленно высвобождающими активное вещество биореакторами. Данные работы находится на стадии экспериментов in vitro.

Была разработана эритроцитная система направленной доставки фосфорилированных аналогов нуклеотидов в макрофаги, пораженные вирусом ВИЧ-1 [Rossi 1999, Rossi 1998, Magnani 1997, Magnani 1996, Benatti 1996, Fraternale 1999], вирусом Herpes simplex [Rossi 1998] или Mycobacterium avium [Rossi 1999]. Эта система основана на возможности инкапсулирования фосфорилированных препаратов в аутологичные эритроциты с последующей селективной модификацией их мембран для распознавания и фагоцитирования таких эритроцитов макрофагами [Magnani 1997]. Этими же авторами была разработана специальная установка “Red Cell Loader” для приготовления методом обратимого осмотического лизиса эритроцитов, нагруженных препаратами, изначально не диффундирущими через эритроцитарную мембрану [Magnani 1998 BAB].

Доставка с помощью эритроцитов-переносчиков в человеческие, кошачьи и мышиные макрофаги была эффективнее в отношении ВИЧ-1, кошачьего вируса иммунодифицита (FIV) и мышиного иммунодифицитного вируса LP-BM5 по сравнению со стандартным введением нуклеотидных аналогов [Magnani 1997].

На клеточных моделях СПИДа in vitro показана эффективность эритроцитов, наполненных дидеоксицитидин-5-трифосфатом (DDCTP) [Rossi 1993, Magnani 1994 ]. В работе [Magnani 1994] сообщается, что макрофаги кошачьих, инфицированные FIV, были обработаны DDCTP -нагруженными эритроцитами, при этом наблюдалось подавление продукции и активности вируса. В работе [Rossi 1993] сообщается, что мышам с MAIDS (мышиной моделью СПИДа) вводили эритроциты-переносчики DDCTP в комбинации с 2-3-дидеоксицитидином (DDC), также наблюдалось подавление продукции и активности вируса.

Был разработан и синтезирован специальный препарат ди(тимидин-3-азидо-2,3-дидеокси-D-рибозид)-5-5-p1-p2-пирофосфат (AZTp2AZT), который при свободном введении показывал эффективность, сравнимую с уже существующим препаратом азидтимидином (AZT), а при введении в эритроцитах показывал большую эффективность in vitro [Magnani 1997, Magnani 1996, Benatti 1996, Fraternale 1999] и in vivo на мышах [Magnani 1998, Fraternale 1999] из-за постепенного выхода из эритроцитов действующего активного агента AZT.

Описаны попытки использования эритроцитов как биореакторов, способных преобразовывать непроходимые через эритроцитарную мембрану предшественники активных форм азидтимидина (AZT) и этамбутола (ЕМВ) такие как AZTpEMB, AZTpEMBpAZT, AZTp2EMB, в активные формы, проходящие через мембрану эритроцита и действующие на ретровирусы и микобактерии. Показано, однако, что только AZTp2EMB гидролизируется в эритроцитах с медленным высвобождением во внеклеточное пространство AZT и ЕМВ со временем полуснижения концентрации AZTp2EMB в эритроцитах 48 часов при 37^оС. Была показана эффективность такого препарата in vivo на мышах [Rossi 1999].

Аналогично был разработан комплекс азидтимидина (AZT) и акловира (ACV), противогерпетического препарата. Гетеродинуклеотидный комплекс AZTp2ACV был инкапсулирован в аутологичные эритроциты, модифицированные для лучшего распознавания и фагоцитирования макрофагами. Была показана эффективность такого препарата in vitro [Rossi 1998].

Исследовалась возможность осуществления направленного транспорта эритроцитов, к мембранам которых «пришивали» антитела к коллагену человека (1 типа). Этот белок не взаимодействует с кровью, пока эпителий не поврежден. Показано, что эритроциты, несущие антитела к коллагену 1 типа, входят в поврежденные участи сосудов человека в 11 раз лучше, чем нормальные эритроциты [Самохин 1986 ].

Существует довольно много лекарственных препаратов для которых необходим направленный транспорт в селезенку и печень, что можно обеспечить с помощью эритроцитов-переносчиков. Доставка в пораженные селезенку и печень описана для некоторых противоопухолевых препаратов: метотрексата [DeLoach Barton 1981 AJVR], цитозинарабинозидтрифосфата [Zimmermann 1978 JClinChemClinBio], антрациклиновых антибиотиков [DeLoach 1983 J Appl Bio].