1. Оптимизация действия лекарственных препаратов при использовании различных носителей.

Использование носителей (переносчиков) лекарственных препаратов дает возможность оптимизировать лекарственное воздействие этих препаратов на организм. Создание новых лекарственных форм препаратов, связанных с переносчиками, направлено на увеличение эффективности и снижение токсичности этих препаратов. Использованием переносчиков лекарственных препаратов можно достичь их защиты от преждевременного разрушения и инактивации; предотвратить или уменьшить иммунные реакции организма на введенный препарат; осуществлять направленный транспорт препарата в те органы и ткани, где его применение оптимально.

Важной предпосылкой успеха в применении фармакологически активных веществ является специфичность. Однако большая часть веществ взаимодействует также и с неспецифическими мишенями, что хорошо показано на примере химиотерапии онкологических заболеваний: медленный прогресс в этой области является следствием неспособности цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки.[Гаузе-1987]. Низкая селективность лекарственного препарата часто усугубляется развитием лекарственной устойчивости опухолевых клеток к стандартным формам препарата. Для решения этой проблемы функциональные молекулы, могут доставляться к месту непосредственного действия с помощью переносчиков.

Необходимые требования к переносчикам лекарственных препаратов - нетоксичость и способность к биодеградации.

Переносчики лекарственных препаратов можно разделить на три группы: макромолекулярные переносчики, микроконтейнеры и клетки.

Примером макромолекулярных переносчиков являются иммуноглобулины. Так, противоопухолевые препараты в комплексе с антителами показали большую цитотоксичность для злокачественных клеток, обладающих антигенами, соответствующими переносчикам-иммуноглобулинам [Rubens 1974, Gregoriadis 1989]. Однако, несмотря на свою привлекательность, подход с применением переносчиков-антител связан с рядом трудностей, среди которых наиболее важные - выделение антигенов и получение их в препаративном количестве. Одной из групп макромолекулярных переносчиков являются асиалогликопротеины. Они высокоспецифичны в условиях in vitro к клеткам паренхимы печени. Используя асиалофетуин, оказалось возможным направить в печень лизоцим и альбумин, сшитые с этим белком [Rogers 1973]. Таким же образом можно использовать агалактогликопротеины и агексозамин гликопротеины, обладающие тропностью соответственно к печени и почкам [Stockert 1974]. Другими потенциальными молекулами-переносчиками являются трофические гормоны, лектины и некоторые лизосомальные ферменты [Hickman 1974]. В отличие от антител, многие из этих веществ легкодоступны, однако, им недостает широты выбора мишени, присущей группе иммуноглобулинов. При другом подходе используются способности некоторых типов клеток (например, фагоцитов и некоторых злокачественных клеток) к активному эндоцитозу специфических макромолекул. Перспективным препаратом является НРМА [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide]-полимер-связанный доксорубицин. Этот препарат является полимерной молекулой, содержащей доксорубицин (около 8,5 %). Эта лекарственная форма показала высокую противоопухолевую активность на мышиных моделях; его применение особенно эффективно в клеточных моделях солидных опухолей. Увеличение активности по сравнению со свободным доксорубицином связано с преимущественным захватом этого препарата опухолевой тканью и последующим локальным выходом доксорубицина из комплекса с переносчиком. У НРМА-полимер-связанного доксорубицина снижена как кардиотоксичность, так и общая токсичность в сравнении со свободным доксорубицином [Fraier 1995]. Также переносчиком лекарственных препаратов может являться ДНК [Trouet 1972], с которой можно связать контактным способом такие цитотоксические препараты, как дауномицин (рубомицин) и доксорубицин. Эксперименты с ДНК-связанными дауномицином (DNR-DNA) и доксорубицином (ADR-DNA) показали, что сниженная токсичность связанного препарата и повышенное поглощение комплекса ДНК-антибиотик опухолевыми клетками увеличивают эффективность препарата при лечении животных с опухолями [Trouet 1972]. Также существуют работы, где описаны попытки применения такого препарата в клинике: показано, что комплекс ADR-DNA так же эффективен, как свободный доксорубицин при лечении некоторых карцином, комплекс DNR-DNA так же эффективен, как свободный рубомицин при лечении острого нелимфобластного лейкоза, комплекс ADR-DNA был более эффективен, чем DNR-DNA при лечении острых лимфобластных лейкозов. Во всех случаях применения комплексов с ДНК кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков была снижена по сравнению со стандартной формой препарата [Trouet 1979, Cornu 1974]. В другом исследовании комплекс ADR-DNA исследовали при терапии острых миелоидных лейкозов у детей. Показано изменение фармакокинетики доксорубицина в крови (увеличение среднего уровня препарата), показана хорошая переносимость DNR-DNA , но побочные эффекты были сравнимы со стандартной формой доксорубицина. После терапии с использованием DNR-DNA и цитозин арабинозида (ara-C) из 16 детей у 14 была достигнута ремиссия [Lie 1979]. Однако все исследования комплексов ДНК с антрациклиновыми антибиотиками относятся к семидесятым годам, в настоящее время они не проводятся.

Вообще следует отметить, что клинические исследования с макромолекулами-переносчиками представлены не значительно, в основном потому, что эти формы эффективны in vitro, но in vivo они плохо циркулируют в кровотоке. После введения они выводятся так же быстро, как и свободные препараты, а иногда и скорее.

Эффективными переносчиками являются микроконтейнеры, которые способны переносить вещества внутри некоторого пространства, защищенного от внешних воздействий. Такими переносчиками могут служить как небиодеградируемые синтетические системы (например, нейлоновые полупроницаемые микрокапсулы) [Грачева 1978], так и биодеградируемые системы [Woodland 1973, Gregoriadis 1977, 1989, Sukhorukov 1998, Bobreshova 1999]. Примером таких биодеградируемых систем являются микросферы из альбумина или казеина. При использовании их для транспорта 5-фторурацила, противоопухолевого антиметаболита, показана эффективность таких переносчиков in vitro, а также in vivo на мышах [Truter 1995, Latha 1994]. Перспективными носителями являются микрокапсулы из полимолочной кислоты: так, микрокапсулы с циклазоцином дают возможность пролонгировать действие этого препарата [Woodland 1973]. Интерес представляет методика создания микрокапсул, согласно которой на положительно заряженный агрегат из не реактивного вещества наносятся слои отрицательно заряженных коллоидных частиц, которые, собственно, и являются оболочкой микрокапсул. После этого «ядро» растворяется и остается полая оболочка, внутрь которой помещают вещество, необходимое для транспортировки [Sukhorukov 1998, Bobreshova 1999].

Самым распространенным классом микрокапсул являются липосомы. Материалом для таких переносчиков являются гидрофобные полярные фосфолипиды, из которых образованы сферические бислойные липосомы [Gregoriadis 1977, 1989]. Физические свойства липосом могут быть различными: радиус может изменяться приблизительно от 12 нм для моноламеллярных липосом до нескольких микрон для мультиламеллярных липосом, а поверхность липосом может нести положительный или отрицательный заряд. Изменения различных физических характеристик липосом и способа их введения дают возможность при помощи липосом варьировать как скорость выведения из кровообращения, так и распределение в тканях веществ, инкапсулированных в них. При этом в липосомы можно ввести не только водорастворимые вещества, но и жирорастворимые препараты, а также белки, гидрофобные области которых могут быть иммобилизованы в липидное пространство бислоев [Gregoriadis 1972]. Например, внутривенно вводимые липосомы достаточно быстро выводятся из кровотока, и заключенные в них недиффундирующие вещества (в частности, ферменты) попадают преимущественно в печень и селезенку [Gregoriadis 1972] после разрушения там липосом. Хорошо диффундирующие вещества, такие как 5-фторурацил [Valero 1999] и пенициллин [Gregoriadis 1973], медленно высвобождаются, хотя липосомы в этом случае тоже циркулируют недолго, выводясь из кровотока печенью. Созданы липосомы из фосфолипидов, устойчивых к кишечным фосфатазам, которые способны транспортировать инсулин из кишечника в кровяное русло и снижать уровень глюкозы в крови у нормальных и диабетических мышей [Dapergolas 1976]. Целевую доставку липосом можно обеспечить встраиваним в поверхность липосом специфичных антител [Matthay 1986, Peeters 1988]. Также было обнаружено, что встраивание в структуру липосом сиалогликопротеинов, экстрагированных из мембраны эритроцитов, может способствовать связыванию в условиях in vitro таких липосом с эритроцитами в присутствии лектинов. Так, десиалированный фетуин (проявляющий аффинность к клеткам паренхимы печени), встроенный в поверхность липосом, способствует поглощению липосомального блеомицина клетками печени [Gregoriadis 1975].

Эффективность направленой доставки липосом в области-мишени тела в значительной степени будет зависеть от решения двух вопросов. Во-первых, в тех случаях, когда мишень не является клетками паренхимы печени или не относится к ретикулоэндотелиальной системе необходимо уменьшение взаимодействия с печенью и селезенкой. Во-вторых, размеры и состав липосом должны быть изменяемы таким образом, чтобы позволить проникновение через различные анатомические барьеры. Существование минимального (12 нм) радиуса липосом затрудняет эту задачу.

Липосомы особенно перспективны для терапии онкологических заболеваний [Gregoriadis 1989, Valero 1999, Краснопольский 1998].

В одной из первых работ по применению липосомальных форм противоопухолевых препаратов липосомы, содержащие меченый блеомицин, вводили онкологическим больным, имеющим печеночные метастазы. Было показано, что липосомы быстро накапливаются в печени, однако не было замечено преимущественного попадания препарата в клетки опухоли [Segal 1976].

Были разработаны липосомальные формы метотрексата. На мышах было обнаружено, что при применении липосом ингибирование роста раковых клеток в 5 раз эффективнее , чем при введении свободного препарата из-за гораздо большего поглощения таких липосом почечными клетками [Singh 1991].

Были созданы липосомальные формы противоопухолевых прапаратов - производных платины. Такие формы оказались стабильными, они имели не большую токсичность, чем стандартные формы препарата за счет изменения фармакокинетики, и также показали хорошую активность на мышиных моделях различных опухолей [Lautersztain 1986, Bandak 1999, Каледин 1996].

В липосомы была введена олтрансретиноидная кислота (ATRA) и такая липосомальная форма была использована в курсах монотерапии в клиническом исследовании у пациентов с первичным острым промиелоцитарным лейкозом. Отслеживалась частота полных гематологических ремиссий. Этот показатель для липосомальной формы ATRA был сравним с таковым при терапии ATRA и идарубицином [Estey 1999].

В течение многих лет предпринимались попытки создания липосом с рубомицином (даунорубицином) и доксорубицином, антрациклиновыми антибиотиками, широко применяющимися в онкологии. В настоящее время получены и успешно проходят клинические испытания липосомы с даунорубицином (DaunoXome) [Gill 1995, Cortes 1999, Verdonck 1998]. Показано, что этот препарат более эффективен по сравнению со свободным даунорубицином, при введении больным с саркомой Капоши, развившейся у больных СПИДом [Gill 1995]. Также DaunoXome проходит клинические испытания при лечении больных с острыми лейкозами [Cortes 1999, Verdonck 1998]. При введении липосомной формы препарата отмечается снижение токсичности антибиотика [Gill 1995, Cortes 1999], а в некоторых случаях – частичное снятие множественной лекарственной резистентности [Verdonck 1998]. Введение липосомной формы изменяет фармакокинетику препарата: DaunoXome выводится гораздо медленнее из организма, его высокие концентрации в плазме обнаруживаются гораздо дольше по сравнению со свободным даунорубицином. При введении даунорубицина в липосомах значительно увеличивается время циркуляции препарата и площадь под фармакокинетической кривой [Gill 1995]. Нужно отметить, что применяя липосомы можно значительно увеличивать разовые дозы антрациклиновых антибиотиков без существенного увеличения токсичности [Cortes 1999].

Разработана и испытывается в клинике липосомная форма доксорубицина Doxil [Valero 1999]. Основой технологии получения этих липосом является применение полимера для покрытия обычных липосом (следует отметить, что почти во всех последних иследованиях липосом используются полимерные покрытия липосом). Это полимерное покрытие (PEG-EE) является производным полиэтиленгликоля. Эта оболочка позволяет липосомам избегать узнавания и удаления иммунной системой, что приводит к увеличению времени циркуляции в кровотоке в экспериментах на мышах. Doxil также характеризуется более высоким значением площади под фармакокинетической кривой. [Hong 1999, Tseng 1999].

Исследование механизмов взаимодействия липосом с клетками показало, что существует два механизма ассоциации липосом с клетками: эндоцитоз и слияние. Первый механизм имеет место как в условиях in vitro, так и in vivo у клеток, способных к активному эндоцитозу. В результате этого процесса вещества, связанные с липосомами, оказываются в лизосомах, где они высвобождаются, и в случае, если такие вещества сохраняют свою активность в лизосомальной среде, они способны оказывать воздействие. С другой стороны, в тех случаях, когда физические свойства веществ позволяют, эти вещества могут диффундировать из лизосом и достигать других клеточных областей. Также, в дополнении к процессу эндоцитоза, возможно слияние липосомных бислоев с клеточными мембранами в условиях in vitro. Это может привести либо к встраиванию жирорастворимых веществ (находящихся в липидной фазе липосом) в клеточную мембрану, либо к попаданию водорастворимых соединений (помещающихся в водном пространстве липосом) в цитоплазму клетки [Gregoriadis 1977].

Несмотря на широкие и интенсивные исследования липосом, несмотря на возможности использования липосом, показанные in vitro на культурах клеток, in vivo на животных липосомальные формы многих препаратов очень быстро выводились из кровотока. Возможно, по этой причине в клинической практике исследование липосомальных форм происходит лишь для небольшого числа препаратов. Все такие исследования находятся на стадии клинических испытаний.

В качестве переносчиков лекарственных препаратов можно использовать целые клетки. Преимуществами клеток как переносчиков являются: их доступность, биосовместимость, способность к биодеградации, возможность длительной циркуляции в организме.

Описан метод лечения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры с помощью тромбоцитов-переносчиков винбластина [Ahn 1978]. Винка-алкалоиды винбластин и винкристин широко применяются при лечении лимфопролиферативных заболеваний, миеломной болезни, острых лейкозов и других онкологических заболеваний [Гаузе 1987, Vidal 2000]. В работе [Ahn 1978] больным вводился вибластин, связанный с тромбоцитами (после инкубации тромбоцитов в растворе винбластина при температуре 37^oС в течение 1 часа), с последующей обработкой тромбоцитов антителами. Введение такого препарата показало хороший терапевтический эффект [Ahn 1978, Simon 1987, Penneys 1982 ]. Также были использованы тромбоциты, нагруженные винбластином, для лечения больных с аутоимунной гемолитической анемией [Ahn 1983].

Из клеток, используемых в качестве переносчиков, наиболее удобными представляются эритроциты. Исходно идея использования эритроцитов-переносчиков принадлежит Ihler [Ihler 1973] и Zimmermann [Zimmermann 1976] независимо. Преимущества, достигаемые при использовании эритроцитов-переносчиков [Ihler 1973, Pitt 83]:

1. Находясь внутри эритроцита лекарственный препарат в ряде случаев может предохраняться от разрушения и инактивации в русле крови.

2. Удлиняется срок нахождения препарата в организме. Для эритроцитов-переносчиков время жизни в кровотоке теоретически может быть равно времени жизни нормальной клетки. При этом в русле крови довольно долгое время может поддерживаться некоторая концентрация препарата.

3. Отсутствуют или снижаются реакции иммунной системы организма на введение препарата, защищенного эритроцитом-переносчиком.

4. Возможно осуществление направленного транспорта лекарственных средств в органы и клетки-мишени (ретикулоэндотелиальной системы - РЭС).

В литературе для эритроцитов-переносчиков обычно используются термины: эритроциты, нагруженные (заполненные) препаратом; препарат, связанный с эритроцитами; эритроцитарная иммобилизованная форма препарата; фармакоциты. В данной работе преимущественно будет использоваться термин эритроциты-переносчики.

Свойства эритроцитов-переносчиков сильно зависят от способа приготовления. В зависимости от поставленных задач возможно создание либо малоповрежденных (максимально сходных с нормальными) эритроцитов-переносчиков, либо специально обработанных так, что после их введения в организм в течение нескольких часов все окажутся выведенными из кровотока РЭС. В первом случае возможно продление времени циркуляции препарата и увеличение его противоопухолевого действия. При этом в эритроциты может быть введен препарат, медленно диффундирующий наружу, или фермент, который взаимодействует с низкомолекулярным субстратом, легко проникающим внутрь клетки из кровотока. В этом случае очень важно, что препараты, работающие внутри эритроцитов-носителей, защищены от иммунных реакций. Специально обработанные или частично поврежденные фармакоциты могут быть использованы для быстрого направленного транспорта лекарственного препарата в органы ретикулоэндотелиальной системы.