Суспензійні культури клітин

Метод культивування клітин у суспензії широко ввійшов у вірусологічну практику у зв’язку з його перспективністю при накопиченні великої кількості клітин. Цей метод затвердив себе у виробництві ферментів та інших продуктів життєдіяльності бактеріальних клітин, проте адаптація клітин ссавців до суспензійних умов має певні труднощі, так як клітини тварин у порівнянні з бактеріальними більш чутливі до фізичних факторів, легше осаджуються, досить вимогливі до складу поживних середовищ і повільніше розмножуються.

Розповсюдженню методу суспензійного культивування сприяло введення ферментативного диспергування тканин тварин і особливо виведення постійних клітинних ліній, які виявилися здатними до необмежено тривалого пасування у суспензійному стані.

Переваги методу культивування клітин у суспензіях:

• висока однорідність суспензій;

• можливість підтримання клітин у логарифмічній фазі росту;

• перспективи математичного моделювання процесів клітинного росту в залежності від впливу факторів зовнішнього середовища;

• зручність багатократного дослідження фізіологічного стану культури клітин у суспензії;

• висока економічність методу.

У зв’язку з цим великого значення набули дослідження штамів клітин, які здатні до тривалого розмноження в суспензійних умовах культивування. Так, були адаптовані багато постійних культур клітин до розмноження в цих умовах (ВНК-21, Hep-2 та ін.). Крім того, потрібно зазначити, що кровотворні клітини краще ростуть у суспензійній культурі.

Запропоновано декілька підходів, які дозволяють культивувати клітини у стані завису: batch-культури (розмноження в суспензії забезпечується безперервним перемішуванням завису в умовах постійності середовища), проточні системи (хемостати, турбідостати), застосування мікроносіїв (сефадекс, силікагель, цитолар та ін.). Культивування на мікроносіях в наш час є досить популярним методом, оскільки дозволяє вирощувати залежні від прикріплення до твердого субстрату клітини (первинні, субкультури, диплоїдні) в умовах суспензії.

Зберігання культур клітин

Для попередження забруднення клітинних культур клітинами інших типів (міжвидове перехресне забруднення), патогенними бактеріями й грибами, а також для попередження виникнення неконтролюємих генетичних змін клітин постає необхідність у їх консервації. При консервації клітин їх, в основному, зберігають в умовах знижених температур від 4 ⁰С до – 78 ⁰С (при зберіганні в умовах сухого льоду) та – 196⁰ С (при зберіганні в умовах рідкого азоту). При зберіганні клітин в умовах низьких температур може відбуватися їх ушкодження при заморожуванні та відтаванні. Ці ушкодження клітин обумовлені появою внутрішньоклітинних кристалів льоду та осмотичними ефектами. Додавання кріопротекторів (диметилсульфоксид, етиленгліколь, гліцерин та ін.), а також підбір оптимальних швидкостей заморожування та відтавання зводять ушкодження клітин до мінімуму.

Умови культивування клітин in vitro

Перенесення клітин цілісного організму в штучні умови життя припиняє їх існування як одного з чисельних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніш входили. При цьому клітини виходять із під контролю нейрогуморальних факторів організму і набувають таких особливостей, які залежать від самого факту їх існування в штучних умовах. Це проявляється, насамперед, в збільшенні швидкості розмноження клітин у культурі порівняно з їх розмноженням в організмі тварини .

Культивування клітин in vitro залежить від наступних факторів:

1. Дотримання стерильності, яка необхідна для забезпечення захисту культур від контамінації їх бактеріями, грибами, вірусами та клітинами інших культур. Стерильними повинні бути приміщення, в яких відбувається маніпуляція з культурами клітин, посуд, інструменти, поживні середовища, вихідна тканина та ін.

2. Щільності популяції клітин. При досягненні певної межі щільності популяції клітин у певному об’ємі подальше розмноження клітин припиняється. Це стосується як клітин, що схильні до контактного гальмування, так і гетероплоїдних клітин, що формують багатошарові пласти на склі. Щільність популяції клітин в постійних культурах у суспензії не повинна перевищувати 5 х 10⁶ кл/мл. Для перфузійних клітин в хемостатах, де періодично здійснюється подача поживного середовища й видалення продуктів метаболізму, диплоїдні, псевдодиплоїдні та гетеродиплоїдні клітинні лінії утворюють щільні популяції (2 х 10⁹ кл/мл) та багатошарові культури.

3. Вмісту поживного середовища - неорганічних речовин, вуглеводів, білків, амінокислот, гормонів, вітамінів та інших біологічно-активних речовин, газового середовища. Так, двоокис вуглеця є продуктом обміну і відразу зв’язується з катіонами середовища. Іон двоокису вуглеця виконує функцію буфера у ібльшості поживних середовищ. Для підримання певного тиску двоокису в атмосфері її додатково вводять в сосуди для культивування чи закривають їх герметично і той двоокис, що утворився в процесі культивування, зберігається.

4. рН середовища. Для оптимального росту більшість клітин in vitro оптимум рН біологічних рідин має бути між 7,2-7,6 та небажано відхилення рН від меж 6,8-7,8.

5. Температури культивування. Для більшості клітин ссавців та птахів оптимальною є температура 37-38,5 ºС. Якщо температура підвищується, це згубно діє на клітини, і при температурі 45 ºС клітини гинуть протягом однієї години.епітеліальні клітини шкіри та інших тканин ембірону людини краще ростуть при температурі 35-36 ºС. Більшість клітин риб культивують при температурі не вище 20 ºС. Тканини амфібій також краще виживають при низькій температурі.

6. Осмотичного тиск. Для клітин ссавців оптимальним при 37-38 ºС є тиск 7,6 атм, хоча клітин можуть переносити значні коливання тиску, якщо ці коливання відбуваються не дуже швидко. Осмотичний тиск визанчається головним чином іонами хлористого натрія, інші іони також суттєво впливають на осмотичний тиск, оскільки він значно збільшується при підвищенні концентрації глюкози.