Глава 2. Методика эксперимента и методы исследования

При проведении исследования использовали растворы каталазы печени быка со степенью чистоты RZ=A405/A280=0.68, доводимый до нужной концентрации K-Na-фосфатным буфером рН 7,4 (0,1 М).

Растворы каталазы нужной концентрации готовили растворением навески каталазы в K-Na-фосфатном буфере рН 7,4 (0,1 М). Концентрацию определяли спектрофотометрически при длине волны 405 нм, используя коэффициент молярной экстинкции 405=324000 М-1см-1.

K-Na-фосфатный буфер рН 7,4 (0,1 М) готовили смешиванием 19 мл 0,2 молярного раствора KH2PO4 c 81 мл раствора NaH2PO4 (0,2 M) и доведением полученной смеси дистиллированной водой до 200 мл [Error: Reference source not found].

Растворы каталазы различной концентрации (1∙10-6, 2∙10-6 моль/л) с рН 7,4 подвергали действию трехчасовой вибрации на частоте 8, 16, 24 и 32 Гц с помощью электромеханического преобразователя, подключенного к генератору сигналов Г6–27.

Для растворов каталазы регистрировались спектры поглощения в видимой области спектра в интервале длин волн 340 –540 нм через каждые 20 мин от начала вибрации. В качестве контроля служили спектры каталазы до вибрации. Спектры регистрировали на спектрофотометре СФ-26 в кварцевых кюветах толщиной 1 см относительно фосфатного буфера рН 7,4.

Спектры поглощения обрабатывались в программе Excel. Для всех спектральных полос рассчитывали интегральную интенсивность спектра поглощения по формуле Симпсона:

(2.1)

где: h-шаг промера спектральной полосы.

На основании данных спектрофотометрических исследований строились зависимости прироста интегральной интенсивности спектра поглощения относительно контроля от времени вибрации.

Глава 3. Экспериментальная часть. Изучение влияния низкочастотных механических колебаний в диапазоне частот 2-32 Гц на конформационное состояние фермента каталаза методом спектрофотометрии.

В ходе экспериментов регистрировали спектры поглощения растворов каталазы с рН 7.4 различных концентраций (1∙10-6, 2∙10-6 моль/л) в течение трехчасовой вибрации через каждые 20 минут воздействия механических колебаний.

При вибрации с частотой 2 Гц наблюдали увеличение интенсивности спектров (рис. 3.1) в зависимости от продолжительности воздействия фактора, что указывает на возможные изменения в стереохимии активного центра каталазы.

При вибрации растворов каталазы с частотой 8 Гц незначительное увеличение интенсивности спектров поглощения наблюдали для более разбавленных растворов. В концентрированных же растворах влияние вибрации было минимальным – величины максимумов поглощения и интенсивность спектров практически не менялись в течение всего времени эксперимента (рис. 3.2). Подобную картину наблюдали при воздействии механических колебаний с частотой 16 Гц (рис. 3.3), что свидетельствует о конформационной устойчивости растворов каталазы с рН 7.4 в этом диапазоне частот.

При вибрации растворов с частотой 24 Гц наблюдали значительное изменение спектров поглощения в ходе вибрации – интенсивность спектров возрастала, что, по всей видимости, указывает на диссоциацию фермента на субъединицы и, как следствие, может привести к потере функциональной активности фермента (рис. 3.4). Была выявлена зависимость прироста интенсивности от концентрации исследуемого раствора, так же, как и при вибрации с частотой 32 Гц.

Рис. 3.1. Спектры поглощения раствора каталазы различной концентрации (а – 1е-6; б – 2е-6 моль/л) при обработке их вибрацией с частотой 2 Гц .

Рис. 3.2. Спектры поглощения раствора каталазы различной концентрации (а – 1е-6; б – 2е-6 моль/л) при обработке их вибрацией с частотой 8 Гц: .

Рис. 3.3. Спектры поглощения раствора каталазы различной концентрации (а – 1е-6; б – 2е-6 моль/л) при обработке их вибрацией с частотой 16 Гц: . 32 Гц

Рис. 3.4. Спектры поглощения раствора каталазы различной концентрации (а – 1е-6; б – 2е-6 моль/л) при обработке их вибрацией с частотой 24 Гц: .

Рис. 3.4. Спектры поглощения раствора каталазы различной концентрации (а – 1е-6; б – 2е-6 моль/л) при обработке их вибрацией с частотой 24 Гц: .

Еще большее увеличение величины интенсивности спектров поглощения – гиперхромный эффект - наблюдали при вибрации растворов каталазы с частотой 32 Гц (рис. 3.5).

Рис. 3.5. Спектры поглощения раствора каталазы различной концентрации (а – 110-6; б – 210-6 моль/л) при обработке их вибрацией с частотой 32 Гц: .

Вероятно, увеличение амплитуды механической волны усиливает процесс образования свободных радикалов и деструкцию аминокислотных остатков, что вызывает изменения в стереохимии гема, наблюдаемые при регистрации спектров в видимой области.

По результатам экспериментов были рассчитаны значения интегральной интенсивности спектров поглощения растворов каталазы. Из графиков зависимости интегральной интенсивности от времени вибрации очевидно, что интенсивность спектров не менялась в течение трех часов эксперимента для растворов каталазы с меньшей концентрацией при воздействии механических колебаний в диапазоне частот 2 – 16 Гц (рис. 3.6, графики 1-3) (прирост интенсивности составлял порядка 10% по сравнению с контролем). При вибрации с частотой 24 Гц наблюдали значительное увеличение интегральной интенсивности (47%) (рис. 3.6, график 4), а с частотой 32 Гц (рис. 3.6, график 5) прирост интенсивности составил 62 %. Зависимость интегральной интенсивности от времени и частоты колебаний представлена на рис. 3.7.

Анализ полученных зависимостей каталазной активности фермента от времени вибрации, а также характера изменения спектров поглощения растворов в ходе вибрации позволяет предположить изменение спектров поглощения в ходе вибрации также указывают на возможную диссоциацию фермента в процессе вибрации, что и снижает функциональные возможности фермента.

Интегральная интенсивность спектров поглощения более концентрированных растворов каталазы (210-6 моль/л) представлена на рис. 3.8-3.9. При вибрации растворов с частотой 8 и 16 Гц значение интегральной интенсивности практически не менялось в течение всего времени вибрации (прирост интенсивности составил до 1 %) (рис. 3.8, графики 2-3). При вибрации растворов с частотой 2 Гц интегральная интенсивность менялась незначительно по сравнению с контролем (11%) (рис. 3.8, график 1).

Рис. 3.6. Зависимость интегральной интенсивности спектра от времени вибрации (концентрация раствора 110-6 моль/л)с частотой: 1 – 2 Гц; 2 – 8 Гц; 3 – 16 Гц; 4 - 24 Гц; 5 – 32 Гц.

Рис. 3.7. Зависимость интегральной интенсивности спектра от времени и частоты вибрации (концентрация раствора 110-6 моль/л).

Увеличение интегральной интенсивности спектров поглощения наблюдали при воздействии колебаний с частотой 24 Гц (на 30 %) и с частотой 32 Гц (на 32 %) (рис. 3.8, графики 4 и 5 соответственно) см. табл. 3.1 . Зависимость интегральной интенсивности от времени и частоты колебаний для растворов с концентрацией 210-6 моль/л представлена на рис. 3.9.

Рис. 3.8. Зависимость интегральной интен-сивности спектра от времени вибрации (концентрация раствора 210-6 моль/л)с частотой: 1 – 2 Гц; 2 – 8 Гц; 3 – 16 Гц; 4 - 24 Гц; 5 – 32 Гц.

Рис. 3.9. Зависимость интегральной интенсивности спектра от времени и частоты вибрации (концентрация раствора 210-6 моль/л).

Табл. 3.1 Результаты моделирования вибрационной инактивации каталазы

В электронных спектрах поглощения при воздействии вибрации наблюдаются изменения не только тирозина, триптофана, собственных хромофоров белка, но и других хромофоров, поглощающих свет в видимой области. Поэтому метод может быть применен для изучения состояния простетических групп в флавинсодержащих ферментах, имеющих гемовую группу. Преобразования в -электронной системе порфиринового кольца приводит к изменению в видимой области спектров поглощения гемсодержащих белков [Error: Reference source not found] и, как следствие, к структурным и функциональным перестройкам.

Рис. 3.10. Зависимость интегральной интенсивности спектра от времени и частоты вибрации (концентрация раствора 210-6 моль/л).

Рис. 3.11. Зависимость интегральной интенсивности спектра от времени и частоты вибрации (концентрация раствора 210-6 моль/л).

Выводы

1. Исследованы спектры поглощения фермента каталаза при воздействии низкочастотных механических колебаний в диапазоне 2-32 Гц.

2. Выявлена зависимость интенсивности спектров от частоты и длительности вибрации, а также от концентрации исследуемых растворов. Эффект вибрации максимален в более разбавленных растворах.

3. Значимые изменения в стереохимии гема, наблюдаемые при регистрации спектров, были отмечены при воздействии механических колебаний с частотой 24 и 32 Гц. В диапазоне частот2-16 Гц влияние вибрации было незначительно, что свидетельствует о конформационной стабильности растворов каталазы с рН 7.4.

4. Изменения в спектрах поглощения являются доказательством структурных перестроек активного центра каталазы, которые в свою очередь, могут привести к изменению ее функциональной активности.

Литература

1. Романов С.Н. Биологическое действие механических колебаний. – Л.: Наука, 1986. – С.208.

2. Хабарова О. В. Биоэффективные частоты и их связь с собственными частотами живых организмов. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.– 2002– №5– С. 56-66

3. Шпицберг В.Л. Выделение и изучение некоторых свойств каталазы эритроцитов человека. // Биохимия. – Т.30. – вып.4. – 1965. – С.801-805.

4. Зайченко И.А. заболеваемость вибрационной болезнью в СССР, причины ее возникновения и основные пути профилактики: Автореф. канд. дис. М. – 1971. - С.23

5. Романов С.Н. Биологическое действие вибрации и звука. Парадоксы и проблемы ХХ века. – Л.: «Наука». – 1991.

6. Машанский В.Ф., Рабинович И.М. Медикобиологические основы вибротерапии. – Л.: «Знание». – 1990.

7. Вибрационная биомеханика. Использование вибрации в биологии и медицине /К.В. Фролов, А.С. Миркин, В.Ф. Машанский и др. — М.: Наука, 1989. С. 142.

8. Шариманов Ю.Г., Буишвили Л.Л. О физико-химических особенностях и антигенной активности отдельных фрагментов у-глобулина человека, полученных под действием ультразвуковых волн // Биофизика. - 1965. - №6. - с.961-966.

9. Степанян Р.С., Айрапетян Г.С., Маркарян Г.Ф. Действие инфразвуковых колебаний на свойства воды и раствора ДНК // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2000. - №4. - с.435-438.

10. Лошицкий П.П. Механизмы воздействия электромагнитных волн низкой интенсивности на воду и водные растворы // Доклады 22-ой Международной научно-практической конференции "Проблемы Электроники". - 2002. - с. 15-47.

11 . Состояние и роль воды в биологических объектах / Под ред. А.И. Каю-шина. - М.: Наука, 1967. - 185 с.

12. Конформационные изменения биополимеров в растворах / Под ред. Э.Л.Андроникашвили. - М.: Наука, 1973. - 372 с.

13. Шпицберг В.Л. Выделение и изучение некоторых свойств каталазы эитроцитов человека. // Биохимия. – 1965. – Т.30. – Вып.4. – С.801-805.

14. Методы и достижения бионеорганической химии. / К. МакОлифф. – М.: Мир, 1978. – 416 с.

15. Крестович В.Л. Введение в энзимологию. – М.: Наука, 1986. – С. 25, 82, 88, 116, 145, 181 – 183.