2. Основы метода спектрофотометрии. Его применимость для исследования биомакромолекул

1. Основные фотометрические законы

Фотометрические методы определения концентрации растворов основаны на сравнении поглощения или пропускания света стандартными и исследуемыми растворами. Степень поглощения света фотометрируемым раствором измеряют с помощью специальных оптических приборов-фотоколориметров и спектрофотометров, в которых световая энергия, проходящая через фотометрируемый раствор, с помощью фотоэлементов преобразуется в электрическую [3].

При прохождении света через слой раствора часть его отражается, часть поглощается и часть света проходит через слой вещества.

При сравнительных измерениях поглощения света различными растворами пользуются одинаковыми кюветами, для которых интенсивность отраженной части светового потока постоянна и мала; потеря света за счет рассеяния при работе с истинными растворами становиться также ничтожно малой. Ослабление света происходит главным образом за счет поглощения световой энергии окрашенным раствором. Интенсивности падающего светового потока и прошедшего через раствор могут быть определены экспериментально.

Связь между интенсивностями падающего светового потока и светового потока, прошедшего через слой раствора вещества , устанавливается законом Бугера-Ламберта, согласно которому однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей на них световой энергии (при постоянной концентрации растворенного вещества). Математически этот закон выражается уравнением экспоненциальной зависимости:

(1.1)

где е- основание натурального логарифма, а- коэффициент поглощения, l- толщина раствора.

Связь между концентрацией поглощающего раствора и его оптической плотностью выражается законом Бера, согласно которому оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества при постоянной толщине слоя:

(1.2)

где - коэффициент пропорциональности; С - концентрация растворенного вещества.

Зависимость интенсивности монохроматического светового потока, прошедшего через слой раствора, от интенсивности падающего потока света концентрации вещества и толщины слоя раствора определяется следующим уравнением:

(1.3)

Здесь k -коэффициент светопоглощения зависящий от природы растворённого вещества, температуры, растворителя и длины волны света .

Это соотношение известное как закон Бугера – Ламберта – Бера является основным законом светопоглощения и лежит в основе большинства фотометрических методов анализа.

Если концентрация С выражена в молях на литр, а l- в сантиметрах, то k становится молярным коэффициентом светопоглощения и обозначается. Уравнение (1.3) в этом случае будет иметь вид:

(1.4)

При соблюдении основного закона светопоглощения оптическая плотность раствора прямо пропорциональна молярному коэффициенту светопоглощения, концентрации поглощающего вещества и толщине слоя раствора:

, (1.5)

где А- оптическая плотность раствора.

Молярный коэффициент светопоглощения зависит от длины волны проходящего света, температуры раствора и природы растворенного вещества и не зависит от толщины поглощающего слоя и концентрации растворенного вещества. Молярный коэффициент светопоглощения отражает индивидуальные свойства соединений и является их определяющей характеристикой.

Правило аддитивности:

Если в растворе содержится n светопоглощающих компонентов, которые не вступают друг с другом в химическое взаимодействие, то при условии соблюдения основного закона светопоглощения оптическая плотность такого раствора будет равна сумме парциальных оптических плотностей всех содержащихся в растворе светопоглощающих компонентов. В этом проявляется принцип аддитивности оптических плотностей:

, (1.6)

где: - молярные коэффициенты светопоглощения компонентов смеси; -молярные концентрации компонентов смеси; - толщина поглощающего слоя, см.