3.2. Выявление биологических объектов

3.2.1. Биологические объекты

Разнообразие выявляемых с помощью гистохимии биологических объектов как с точки зрения химического состава, так и с точки зрения размеров ничем не ограничивается. Можно выявлять объекты на молекулярном уровне, например антигены и рецепторы, или более крупные объекты, такие, как разнообразные субклеточные структуры и органеллы. И, разумеется, окрашивание используется для выявления определенных типов клеток и организмов, для чего в настоящее время часто используется иммунное окрашивание. Традиционным подходом является определение биологических объектов, о чем свидетельствуют такие термины, как «эозинофил» или «грамположительная бактерия».

Механизмы гистохимических методов также слишком разнообразны, чтобы ко всем можно было дать пояснения, отметим только, что в этих методах могут применяться маркеры всех типов, упомянутых и обсуждавшихся выше, или, как в приведенном ниже примере, избирательность может основываться на физических различиях.

Выявление исчерченности в мышцах. Традиционный метод выявления А- и I-дисков в мышцах основывается на образовании in situ координационного комплекса (или комплексов?) железа с гематеином. Избирательность обеспечивается в основном за счет контролируемого вымывания краски (дифференцирования).

Ниже приводится процедура окраски железным гематоксилином по Гейденгайну

Выявление поперечной исчерченности в мышцах

1. Изготовьте продольно ориентированные срезы толщиной 6 мкм со скелетных мышц, залитых в парафин. Ткань может быть зафиксирована любым способом.

2. Распарафинируйте срезы ксилолом и проведите через серию спиртов в воду.

3. Обработайте (протравите) срезы 5%-ным (вес на объем) водным раствором сульфата железа и аммония (железоаммонийных квасцов) в течение 1 часа.

4. Промойте срезы дистиллированной водой.

5. Окрасьте их гематоксилином по Гейденгейну (см. красители) в течение 1 часа. Оптимальное время обработки квасцами и железным гематоксилином зависит от применявшейся фракции. После использования растворов формальдегида (а также паров формалина, фиксаторов Сузи, Буэна и Карнуа) обычно достаточно инкубации в каждом растворе в течение 1 часа. После фиксаторов с бихроматом (например, Ценкера и Гелли) требуется обработка в течение 3 часов, а после фиксаторов, содержащих четырехокись осмия, еще дольше, например после фиксатора Флемминга - до 24 часов

6. Промойте проточной водой.

7. Аккуратно отдифференцируйте срезы, чередуя промывку в дифференцировочном растворе с промывкой в проточной воде. Для дифференцировки в стандартных условиях применяется 5%-ныи (вес на объем) водный раствор сульфата железа и аммония. Другие способы — развести данный раствор равным объемом дистиллированной воды либо воспользоваться насыщенным спиртовым раствором пикриновой кислоты. Оба последних раствора позволяют лучше контролировать процесс дифференцировки. После каждого цикла их следует просматривать в микроскоп. Процедуру проводить до тех пор, пока не будет видна исчерченность мышц.

8. Промойте проточной водой в течение 10 мин.

9. Проведите обезвоживание в серии спиртов возрастающих концентраций, затем в ксилоле, и заключите препарат в синтетическую смолу

Результаты. После окрашивания гематоксилином все структуры становятся черными или серыми. После проведенной на этапе 7 дифференцировки окраска остается в менее проницаемых структурах (перечислены в порядке возрастания устойчивости к дифференцировке): митохондриях, поперечно-полосатых мышцах, хроматине ядра и хромосомах, миелине, эритроцитах, кератине.

Возможные трудности: если после этапа 5 окрашивание слишком бледное, то увеличьте время инкубации в растворах квасцов и гематоксилина. Если вам трудно проконтролировать степень дифференцировки, то попробуйте воспользоваться другим дифференцирующим раствором. Если окраска выцветает со временем, то увеличьте время промывания в воде после окраски.

Биологические процессы

Взаимодействие гистохимических красителей с живыми клетками или организмами позволяет непосредственно наблюдать многие процессы. Определение биологической или химической природы объектов, рассмотренное выше, также используется для выяснения биологических процессов, хотя и менее прямым путем.

С помощью гистохимии можно выявлять процессы, разнообразные как по масштабам, так и по физиологической роли. Можно, например, наблюдать движения ресничек или жгутиков-простейших, если добавить в окружающую их водную пленку окрашенные коллоиды; с помощью рН-зависимых флуорохромов можно следить за изменениями рН в лизосомах во время фагоцитарной активности культивируемых макрофагов; можно непосредственно наблюдать электрическую активность нейронов зрительной коры после включения в них потенциал-зависимых флуорохромов.

Проверка жизнеспособности культивируемых клеток.

Прежде чем начинать работу с культурой клеток, часто бывает необходимо определить в ней долю живых клеток. Один из общепринятых способов состоит в обработке клеток флуоресцеиндиацетатом (ФДА). Благодаря своей гидрофобности это нефлуоресцирующее вещество легко проникает через интактную плазматическую мембрану живых клеток. Под действием лизосомных зстераз ФДА гидролизуется с образованием флуоресцентного красителя — флуоресцеина. Это ионное и, следовательно, гидрофильное вещество накапливается в клетках, так как оно не может пройти через гидрофобную липидную мембрану. В мертвых или поврежденных клетках флуоресцеин либо не образуется совсем, либо выходит через поврежденную мембрану в инкубационную среду.

Выявление живых клеток с помощью флуоресцеиндиацетата (ФДА)

1. Если клетки растут в монослойной культуре, то снимите их с подложки заменив культуральную среду на раствор трипсин-ЭДТА. Готовится раствор трипсин-ЭДТА из 0,05% (вес на объем) трипсина и 0,003% (вес на объем) ЭДТА в физиологическом фосфатном буфере (ФСБ) (0,2 г KCl, 0,2 г KH₂PO₄, 8 г NaCl и 1,15 г Na₂HPO₄ растворить в воде, и довести до 1 л.). Затем проинкубируйте их при комнатной температуре в течение минимального времени, необходимого для отделения клеток от подложки, обычно оно составляет 5—15 минут

2. Отцентрифугируйте клетки и ресуспендируйте их в достаточном объеме ФСБ, чтобы получить концентрацию порядка 10⁶ клеток на мл.

3. Смешайте небольшой объем суспензии клеток с 2,5 объемами рабочего раствора ФДА — это даст вам конечную концентрацию его около 0,1 мкг/мл.

Для приготовления рабочего раствора необходимо приготовить 0,1%-ный исходный раствор ФДА в ацетоне и развести 1 объем этого раствора в 4000 объемах ФСБ. Рабочий раствор должен быть прозрачным (не иметь молочного оттенка) и без осадка. Заключить каплю суспензии под покровное стекло и замазать края силиконовой смазкой.

5. Просмотрите препарат под флуоресцентным микроскопом или в условиях темного поля с лампой накаливания, используя интерференционный фильтр.

Результаты. Живые клетки немедленно дадут яркую зеленую флуоресценцию, интенсивность которой будет возрастать со временем. Поврежденные или мертвые клетки не окрасятся.

Контроль. Поскольку некоторые популяции клеток содержат аутофлуоресцентный материал, то необходимо сделать препарат без ФДА.

Возможные трудности. Если клетки вообще не светятся, то сделайте другой препарат, принимая все меры предосторожности, чтобы избежать механических повреждений.

Морфологические исследования

Используемые для выявления морфологии маркеры опять-таки могут быть химической или биологической природы; механизмы окраски соответственно варьируют и могут включать как физико-химические, так и биологические процессы. Такие методы применяются для:

1) прослеживания нейронных связей путем наблюдения за аксонным транспортом флуорохромов;

2) определения межклеточных пространств в расщелинах между эпителиальными клетками с помощью негативного окрашивания;

3) изучения трехмерного распределения лимфоцитов различных классов в фолликулах лимфоузлов.

Оценка результатов гистохимического окрашивания

После того как гистохимическая реакция проведена, ее результаты необходимо оценить с точки зрения тех вопросов, которые были поставлены вначале. Поскольку гистохимические методы позволяют ответить на вопросы «что это такое?», «где оно находится?» и «сколько его?», то тест на достоверность должен включать проверку всех трех пунктов. Более того, следует рассмотреть значение как положительного, так и отрицательного окрашивания.

Предположим, что после проведения какой-либо реакции вы обнаружили, что препарат окрашен. Прежде чем сделать заключение о том, что искомый объект в нем присутствует, необходимо ответить на следующие вопросы:

1) относится ли окраска именно к тому веществу (структуре), которое вас интересует в препарате? Этот вопрос относится к проблеме специфичности и/или избирательности окраски;

2) соответствует ли распределение красителя распределению искомого объекта в живой клетке, ткани или существе? Этот вопрос относится к проблеме локализации гистохимической реакции;

3) соответствует ли интенсивность окраски количеству присутствующего в препарате вещества? Это вопрос о том, насколько метод количественный.

Теперь предположим, что в результате проведения реакции препарат не окрасился. Прежде чем сделать вывод об отсутствии искомого вещества или структуры, необходимо ответить на следующие вопросы:

1) отражает ли отсутствие окраски неуспех метода или же указывает на отсутствие искомого объекта? Этот вопрос относится к проблеме технического несовершенства и недостаточной чувствительности применяемого метода;

2) возможно ли, чтобы искомое вещество присутствовало в живой клетке (или организме) и было потеряно в процессе изготовления и/или окрашивания препарата. Это проблема стабилизации содержимого препарата;

3) не претерпел ли краситель изменений и не исчез ли он из препарата до начала наблюдений? Этот вопрос относится к проблеме выцветания и диффузии красителей.

В табл. приводятся контрольные процедуры, которые необходимо выполнить для ответа на данные вопросы; обсуждение некоторых из указанных проблем дано ниже. Начинающим исследователям рекомендуется выполнять все требуемые контроли постоянно, а не прибегать к ним только в тех случаях, когда результаты окрашивания кажутся непонятными. .

Методы контроля результатов окрашивания

Возможные артефакты

Контрольные процедуры

Когда препарат окрашен 1. Окрашивание может возникать вследствие связывания не с той мишенью 2. Окрашивание может не отражать локализации вещества in vivo 3. Интенсивность окраски не отражает количества вещества Когда препарат не окрашен 1. Несовершенный или недостаточно чувствительный метод 2. Вещество (активность) исчезло из препарата до окрашивания 3. Окраска исчезла до исследования препарата.

Заблокируйте или экстрагируйте мишень Сравните распределение окраски при различных способах стабилизации материала Окрасьте модельный или стандартный препарат Окрасьте тестовый препарат, воспользуйтесь другим методом; если мишень окраски химическая, то возьмите свежий препарат Измените процедуру, предшествующую окраске (т. е. стабилизацию); если мишень химическая, то возьмите свежий препарат Измените обработку препарата после окраски; постарайтесь исследовать его немедленно после или в процессе окраски

Оценка селективности методов

Если окрашивается действительно искомое вещество или структура, тогда удаление их из препарата (экстракция) либо превращение в химически модифицированную форму (блокирование) должно приводить к исчезновению окраски.

Пример экстракции приведен выше в методиках, где описывается удаление суммарных липидов с помощью органических растворителей. Поскольку такая смесь растворителей не удаляет из препарата другой материал, то любое окрашивание суданом черным, возникающее после экстракции, можно отнести к неспецифическому. Для избирательной экстракции определенных компонентов тканей используется также химический и ферментативный гидролиз. Избирательность данных методов зависит от химических процессов на стадии гидролиза, приводящих к расщеплению биополимеров на фрагменты, которые затем неспецифически экстрагируются растворителем.

Избирательная экстракция гликогена. Она производится с помощью быстрого ферментативного гидролиза гликогена амилазой; при этом другие биополимеры в клетках млекопитающих не повреждаются сколько-нибудь существенно. Подробности данного метода приведены ниже

Экстракция гликогена диастазой

1. Возьмите два положительных контрольных препарата (срезы богатой гликогеном печени) и два тестовых среза. Если они получены из парафиновых блоков, то распарафинируйте их. Во всех случаях срезы необходимо размочить.

2. Проинкубируйте один тестовый срез и один положительный контрольный препарат в 1%-ном (вес на объем) водном растворе диастазы (свежий раствор) в течение 1 часа при 37 °С. Ткани, фиксированные жидкостью Гендра, водным раствором глутарового альдегида или четырехокиси осмия, устойчивы к ферментативному гидролизу. Поэтому время инкубации с диастазой надо увеличить.

3. Промойте препараты в течение 5—10 мин в проточной воде.

4. Окрасьте все срезы по методу для выявления гликогена (периодат-Шифф).

Результаты. На наличие гликогена указывает отсутствие окраски после ферментативной обработки.

Контроль. Положительные контрольные срезы показывают, что фермент активен и методика окраски эффективна.

Блокирование бывает различного характера. Например, если срез ткани интенсивно окрашивается кислыми красителями, то это может быть связано с присутствием в нем белка. Тогда обработка азотной кислотой, в результате которой катионогенные аминогруппы превращаются в неионные гидроксильные группы, должна предотвращать окраску. Аналогичным образом, ферменты могут быть инактивированы в результате нарушения их четвертичной структуры путем нагревания или обработки реакционноспособным альдегидом либо ингибитором. Если после инактивации окрашивание сохраняется, то оно является артефактом и не связано с ферментом. Методы контроля не сводятся только к блокированию и экстракциям. Один из распространенных методов контроля состоит в том, чтобы избирательно пропускать используемые в прописи реактивы, а затем сравнивать получающееся окрашивание с тем, которое получается при полной процедуре. Так, окрашиванию методом периодат—Шифф и реакции Фёлыена мешает присутствие природных альдегидов. Однако их легко выявить, пропустив в стандартной методике соответственно стадии окисления и гидролиза, которые приводят к образованию альдегидных групп, и посмотрев, какие структуры после этого окрасятся.

Оценка локализации окрашивания

На каждой стадии изготовления и окраски препарата его компоненты могут перемещаться с тех мест, которые они занимали in vivo. Сдвиги наблюдаются при многих способах окрашивания, причем иногда даже в процессе хранения окрашенных препаратов. Для уменьшения подобных артефактов используются различные технические приемы, например перфузия вместо погружения в фиксатор, что уменьшает поток растворителя сквозь кусочек ткани. Однако, на самом деле контроль за локализацией веществ проводить сложно. Единственный способ состоит в том, чтобы использовать несколько методов изготовления и окрашивания препарата и сравнивать результаты.

Оценка чувствительности и количественности окрашивания

Чтобы оценить на качественном уровне чувствительность реакции, окрасьте параллельно с исследуемым препаратом еще два известных препарата, которые содержат соответственно много и мало исследуемого вещества. Такой пример в отношении реакции на гликоген был рассмотрен выше.

Для оценки того, является ли метод количественным, можно использовать различные приемы. Можно определить количество вещества в различных препаратах до окрашивания, а затем установить, как коррелирует интенсивность окраски с содержанием вещества. Полученные данные можно затем применить к исследованию новых препаратов. В одном очень важном случае, а именно при количественном определении ДНК, таких измерений обычно не требуется, так как сравнение диплоидных и гаплоидных клеточных ядер дает вам свой внутренний стандарт. Можно использовать внешние стандарты, в качестве которых применяют разные модельные системы. Например, известное количество вещества можно поместить в полимерный матрикс, который затем залить в виде тонкого слоя или нарезать на срезы. Другой способ состоит в том, что вещество наносят на поверхность хроматографических носителей, частицы которых имеют микронные размеры. Такие образцы, содержащие известные количества вещества, затем окрашиваются одновременно с исследуемым биологическим образцом.

Оценка чистоты реагентов

Все поступающие в продажу реактивы — красители, субстраты, проявляющие и цветообразующие вещества, меченые антитела — могут содержать примеси. Состав их может различаться от партии к партии. Если в качестве загрязняющей примеси содержится соль или сурфактант, то они будут влиять на реакцию косвенным образом. Кроме того, в реактиве могут быть примеси, сами по себе окрашивающие препарат, но иначе, чем требуется согласно реакции. В самом деле, этикетка на пузырьке с красителем не всегда отражает его содержимое — коммерческому контролю за качеством нельзя безоговорочно доверять. Более того, следует подчеркнуть, что гистохимические методы используются для изучения более сложных препаратов, чем те, которые исследуются методами препаративной биохимии. Таким образом, последствия недостаточной чистоты реагентов для гистохимии могут быть еще более серьезными, чем для биохимии.

Как же с учетом всего этого следует проверять чистоту реагентов? Химический анализ красителей и других реагентов — это специальное искусство, и если оно окажется для вас необходимым, то способы анализа данных веществ описаны в работах по аналитической химии. Но если вы пользуетесь стандартными гистохимическими методами, то лучше передоверить анализы другим; заказывайте красители с сертификатами. Хотя это не гарантирует вам чистоты красок, но можете быть уверены, что они пригодны для проведения соответствующих гистохимических методик. Другая общая рекомендация состоит в том, чтобы хранить образец хорошей краски для проверки того, не являются ли возникающие у вас трудности следствием загрязненности новых партий красителя.

Кроме проблем загрязнения возникают еще и трудности, обусловленные запутанной номенклатурой, которая может послужить причиной неправильного применения красителей.

Номенклатура реагентов

Гистохимические красители обычно представляют собой сложные органические молекулы и их систематические (номенклатурные) названия так же сложны, из-за чего широкое распространение получили тривиальные названия, акронимы и сложносокращенные названия. Кроме того, многие гистохимические реактивы имеют свои собственные названия в текстильнонй промышленности, где часто одному и тому же веществу разные фирмы присваивали разные торговые названия. Для решения возникающих у вас проблем, связанных с номенклатурой, полезным источником может оказаться справочник «Реактивы и препараты для микроскопии» Д.М.Фрайштата.

Иммуногистохимия

В течение многих лет для идентификации определенных компонентов клеток используются разнообразные гистохимические методики (см предыдущий раздел). Они, однако, не позволяют достичь той избирательности, которая обеспечивается применением антител, а это именно то свойство, которое дает возможность исследователю точно картировать распределение отдельных веществ в тканях. Помимо использования в качестве инструмента для исследований, методы иммуногистохимии в настоящее время все шире применяются для диагностики в гистопатологии, особенно для диагностики опухолей. Перечень областей применения этого метода неизмеримо расширился с развитием технологии получения моноклональных антител. Получен широкий спектр таких антител, причем многие из них обладают такой специфичностью, которую трудно, если не невозможно было бы достичь с помощью обычных антисывороток.

Иммуногистохимия основана на использовании антител для локализации определенных веществ в срезах тканей. Общий подход состоит в том, что срез ткани инкубируют с меченым антителом, затем срез отмывают и участок, где произошла реакция с антителом, идентифицируют, визуализируя метку.

Хотя настоящая глава посвящена в основном использованию антител, сходные методы могут применяться и с другими реактивами, обладающими такой же высокой специфичностью. Например, лектины могут использоваться для определения некоторых групп углеводов. Недавно началось бурное развитие методов, связанных с использованием ДНК в качестве метки для выявления специфических последовательностей в генах или в мРНК.