3.1.3. Классы веществ

Иногда получаемая методами гистохимии информация касается основных классов веществ, но не отдельных химических веществ. Так, мы можем исследовать распределение липидов в проксимальных почечных канальцах, но не можем получить какой-либо информации о конкретном составе данных липидов. Даже в тех случаях, когда существует более подробная химическая классификация, мы можем тем не менее очень мало продвинуться в идентификации отдельных веществ. Так, если пациент страдает от болезни накопления — метахроматической лейкодистрофии, то гистохимическое исследование с целью выявления сульфатидных отложений в макрофагах служит ценным методом диагностики, однако никакого более тонкого химического определения веществ в препарате с его помощью сделатьнельзя.

Еще раз отметим, что лежащие в основе гистохимических методов механизмы окрашивания очень разнообразны и вклю­чают все типы, описанные выше.

Выявление липидов. В основе метода лежит распределение гидрофобных неионных красителей между полярными растворителями и неполярными липидами. Усиление окрашивания после бромирования происходит благодаря тому, что по местам двойных углеродных связей присоединяются атомы брома. Бромные производные менее полярны и обычно имеют более низкую точку плавления, чем их ненасыщенные предшественники, в результате чего повышается сродство красителей к липидам и, соответственно, ускоряется реакция окрашивания.

Ниже приведены методики выявления липидов.

Стандартный метод выявления нейтральных липидов

1. Изготовьте на криостате срезы с нефиксированной почки и зафиксируйте их в течение 1 часа кальций-формолом. Для приготовления кальций-формола разведите 10 мл коммерческого 40%-ного (вес на объем) водного раствора формальдегида водой (до 100 мл). К полученному раствору добавьте 1 г СаСl₂.

2. Смонтируйте срезы на предметные стекла и дайте им подсохнуть.

3 Удалите липиды для получения отрицательного контроля (см. Контроль)

4 Промойте опытные и контрольные срезы в 70%-ном (объем на объем) водном этаноле.

5. Окрасьте опытные и контрольные срезы в течение 15 мин в насыщенном растворе судана черного в 70%-ном (объем на объем) водном этаноле. Перед окраской раствор красителя надо профильтровать

6. Отдифференцируйте срезы в 70%-ном (объем на объем) водном этаноле до тех пор, пока лишенный липидов контроль не станет бесцветным.

7. Промойте водой и заключите в глицероловое желе.

Результаты. Триглицеролы и ненасыщенные эфиры холестерола окрашиваются в сине-черный цвет; некоторые фосфолипиды выглядят коричневыми.

Контроль. Экстрагируйте срезы смесью хлороформ—метанол 2:1 (объем на объем) в течение 2 часов при комнатной температуре. Это позволит удалить все свободные липиды, после чего окраска не возникнет. Из некоторых липопротеинов липиды можно удалить добавлением к метанол-хлороформной смеси 1% (объем на объем) концентрированной соляной кислоты.

Возможные трудности: если в синий цвет окрашиваются ядерные или богатые гликозаминогликанами участки, то замените судан черный.

Выявление суммарных липидов бромом—суданом черным

Возьмите смонтированные срезы и, начиная с этапа 2 предыдущей методики, продолжайте следующим образом.

1. Погрузите срезы в 2,5%-ный (объем на объем) водный раствор брома на 30 мин при комнатной температуре. ОБЯЗАТЕЛЬНО пользоваться вытяжным шкафом.

2. Промойте срезы их в воде, а затем в 0,5%-ном (вес на объем) водном растворе метабисульфита натрия в течение 1 мин.

3. Хорошо промойте в воде. Продолжите процедуру с этапа 3 предыдущей методики.

Выявление фосфолипидов методом бром—ацетон—судан черный

Возьмите обработанные бромом срезы, полученные на этапе 3 пердыдущей методики, и продолжите следующим образом.

1. Хорошо высушите срезы (не должно оставаться даже следов воды, так как в противном случае наряду с -нейтральными липидами проэкстрагируются фосфолипиды).

2. Проэкстрагируйте безводным ацетоном 20 мин при 4 ^ОС.

3. Удалите растворитель и дайте ацетону испариться. Продолжите процедуру с этапа 3 предыдущей методики.

Результаты. Фосфолипиды окрасятся в сине-черный цвет.

Контроль. Удалите суммарные липиды («Контроль» в предыдущей методике), после чего окрашивания не должно быть.