3.1.2. Специфические вещества

Многие вещества можно окрасить специфически. Таким способом можно выявлять полимеры, например полисахариды каллозу и гликоген, структурные белки, такие как коллаген и гемоглобин, а также множество ферментов. Гистохимическими методами можно также выявлять низкомолекулярные вещества, от желчного пигмента до холестерола и различных витаминов. Кроме того, использование в гистохимии гибридизации in situ позволяет с помощью флуоресцентного зонда или радиоактивной метки выявлять многочисленные фрагменты нуклеиновых кислот, от генных последовательностей ДНК до цитоплазматических мРНК. Кроме того, многие биополимеры и другие более мелкие молекулы являются антигенами и могут быть в принципе выявлены с помощью иммуногистохимии.

Механизмы неиммунологического и негибридизационного окрашивания, которые мы здесь рассматриваем, различны. Некоторые вещества (например, желчный пигмент) можно сделать видимыми с помощью маркерного химического фрагмента или комбинации фрагментов. В других случаях маркерным может являться биофизическое свойство молекулы, например ее заряд, гидрофильность или гидрофобность, планарность и т. д. Идентификация может быть основана и на более сложных химических свойствах, как в гистохимии ферментов, где для получения окраски используется специфическая каталитическая активность фермента. Селективность может быть также обусловлена в большей степени свойствами молекулярных агрегатов, а не отдельных молекул — например, коллаген можно избирательно окрасить за счет того, что его фибриллы сильно набухают в кислом растворе.

Выявление сукцинатдегидрогеназы. В этом гистохимическом методе выявления фермента препарат инкубируют в растворе, содержащем сукцинат — природный субстрат фермента — плюс соль тетразолия как индикатор окислительно-восстановительных процессов. В местах локализации фермента от сукцината каталитически отщепляется водород, в результате чего образуется фумарат, а также протоны и электроны. Ферментативный процесс выявляется за счет окисления электронами и протонами соли тетразолия, что ведет к образованию пурпурно-синего нерастворимого пигмента — формазана.

Реактивы, необходимые для выявления сукцинатдегидрогеназы

Концентрированные растворы,

Раствор субстрата

1. Растворите 6,75 г двузамещенного сукцината натрия в 10 мл дистиллированной воды.

2. Если окажется необходимым, доведите рН с помощью 1 М НСl до 7,0—7,1.

Раствор тетразолия

1. Растворите 10 мг тетразолия нитросинего (или тетразолия тетранитросинего) в 2,5 мл дистиллированной воды.

2. Добавьте 2,5 мл 0,2 М Трис-буфера (рН 7,4), 1 мл 0,05 М раствора MgCl₂ и 3 мл дистиллированной воды.

Рабочие растворы

Солевой раствор формалина

1. Смешайте 15 мл коммерческого 40%-ного (вес на объем) водного раствора формальдегида с 85 мл воды.

2. Добавьте и растворите 0,9 г NaCl.

Инкубационный раствор

1. Смешайте 1 мл концентрированного раствора субстрата с 9 мл растворатетразолия. 2. Нагрейте до 37 °С.

Метод выявления сукцинатдегидрогеназы

1. Сделайте на криостате срезы толщиной 5—7 мкм и смонтируйте их на покровное стекло. Не фиксируйте (фермент ингибируется формальдегидом, так что фиксацию для сохранения морфологии ткани можно производить только после окрашивания).

2. Проинкубируйте срезы в течение 30—60 мин при 37 °С в растворе, указанном в табл. 5.13.

3. Перенесите срезы в водный раствор формалина (как указано в табл. 5.13) на 15 мин.

4. Промойте дистиллированной водой.

5. Если необходимо, докрасьте ядра 2%-ным (объем к весу) водным раствором метилового зеленого в течение 10 мин.

6. Промойте дистиллированной водой.

7. Проведите обезвоживание препарата в серии спиртов, затем в ксилоле и заключите его в синтетическую смолу.

Результаты. В местах локализации сукцинатдегидрогеназы откладывается пурпурно-синий формазан. Если применялась докраска метиловым зеленым, то ядра окрашены в зеленый цвет.

Контроль. Для проверки того, что окрашивание зависит от ферментативной активности, проведите процедуру, не добавляя сукцинат в инкубационную среду, или прогрейте сухие срезы при 80 °С в течение 1 часа перед инкубацией (денатурировать фермент).

Возможные трудности: следы розового окрашивания могут быть удалены на 4-м этапе с помощью ацетона. Если сохраняется интенсивное розовое окрашивание, то необходимо заменить соли тетразолия.