3.1.1. Химические фрагменты

С помощью гистохимии можно выявить широкий спектр химических фрагментов: органические радикалы, такие, как аминогруппы, двойные углеродные связи, тиоловые группы, которые замещают какие-либо группы в молекулах биополимеров или являются составной частью мелких молекул. Этими методами выявляются также неорганические ионы, например анионы фосфата или сульфата, катионы кальция или железа, присутствующие как часть неорганических отложений (например в кости) или связанные с органическими лигандами.

Иногда химические фрагменты представляют биологический интерес сами по себе, например отложения кальция при формировании кости или вследствие патологической кальцификации поврежденных тканей. В других случаях химические фрагменты используются в качестве гистохимических маркеров. Так, в тканях часто выявляются альдегидные группы, хотя обычно концентрация их невелика. Тем не менее, можно индуцировать образование альдегидов из таких компонентов ткани, как ДНК или полисахариды. Последующее выявление альдегидных групп позволяет определить эти исходные соединения.

Выявление альдегидных групп. Предлагаемый ниже метод основан на использовании традиционного реактива Шиффа. Этот реактив взаимодействует с альдегидами благодаря своей реакционно-способной ариламиногруппе; богатые альдегидами участки окрашиваются в пурпурный цвет благодаря тому, что в процессе реакции образуется хромофор трифенилметан.

Хотя реактив Шиффа и поступает в продажу, многие исследователи по-прежнему предпочитают готовить его самостоятельно

Приготовление реактива Шиффа

1. Растворите 1 г основного фуксина (парарозанилина или «нового фуксина») в 200 мл кипящей воды.

2. Охладите раствор до 50 °С, добавьте и растворите 2 г метабисульфата калия или натрия.

3. Охладите до комнатной температуры, добавьте 2 мл концентрированной соляной кислоты и в получившемся растворе суспендируйте 2 г активированного угля.

4. Оставьте на ночь в темноте при комнатной температуре.

5. Отфильтруйте активированный уголь и храните раствор красителя в холодильнике в темном контейнере.

Возможные трудности: если раствор после фильтрации по-прежнему остается розовым, то надо заменить метабисульфат. Если раствор имеет оранжевый цвет и дает оранжевый фон при окрашивании, замените основной фуксин.

Выявление альдегидных групп

1. Распарафинируйте срезы, зафиксированные, например, формалином, и перенесите их в воду. Криостатные или пластиковые срезы также поместите в воду.

2. Поместите препараты в реактив Шиффа, на 5-20 мин. (оптимальная продолжительность окрашивания варьирует в зависимости от применяемых реактивов, способов фиксации и заливки материала).

3. Промойте проточной водой в течение 5-10 мин.

4. Промойте 100%-ным этанолом, затем подержите в ксилоле и заключите в синтетическую смолу.

Результат: богатые альдегидными группами участки окрасятся в пурпурный цвет.

Контроль: Окрасьте препарат, заведомо богатый альдегидами, — он послужит положительным контролем. Для этой цели подойдут богатые гликогеном срезы печени. В гликогене альдегидные группы образуются в результате окисления его периодатом; в ДНК альдегидные группы образуются в результате кислотного гидролиза.

Возможные трудности: если контроль не окрашивается, то замените реактив Шиффа. Если опытные срезы не окрашиваются, то прежде чем давать отрицательное заключение, попробуйте увеличить продолжительность обработки на этапах 2 и 3.

Способы избирательного индуцирования альдегидных групп в различных биополимерах

Депуринизация ДНК путем гидролиза

1. Распарафннируйте срезы и перенесите их в воду, намочите криостатные и пластиковые срезы. Для фиксации пригодны большинство фиксаторов, за исключением кислотных (типа фиксатора Буэна), которые сами по себе вызывают гидролиз ДНК и глутарового альдегида, который приводит к образованию альдегидных групп во всей ткани.

2. Поместите срезы в 1 М НСl, предварительно нагретую до 60 °С (можно использовать 5 М НСl при комнатной температуре), и проинкубируйте при данной температуре 10—15 мин. При слишком коротком времени гидролиза не образуются все альдегидные группы, а слишком продолжительный гидролиз приводит к вымыванию ДНК из препарата. Оптимальное время зависит от условия фиксации, так что если препарат оказался бледным, можно изменить продолжительность гидролиза.

4. Далее см. п.2 Выявление альдегидных групп

Данная процедура в сочетании с методом выявления альдегидных групп, описанная выше, называется окрашиванием ДНК по Фёльгену.

Окисление 1,2-карбоксильных групп в полисахаридах

1. Распарафинируйте срезы и перенесите их в воду, намочите криостатные и пластиковые срезы.

2. Обработайте срезы 1%-ной (объем к весу) периодной кислотой в течение 5 мин (время индуцирования образования альдегидных групп может варьировать).

3. Хорошо промойте препарат в нескольких сменах воды.

4. Далее см. п.2 Выявление альдегидных групп

Данный метод в сочетании с процедурой выявления альдегидов, описанной выше, получил название метода окрашивания периодатом — реактивом Шиффа (ШИК-метод, или, по-английски, PAS-метод).