I. Силы, обусловливающие взаимодействие между реактивом и препаратом.

Наиболее распространенными являются короткодействующие межмолекулярные силы, такие как диполь-дипольное и дисперсионное взаимодействия; затем следуют так называемые вандерваальсовы силы. Они участвуют во взаимодействиях между всеми молекулами, но сильнее проявляются в тех случаях, когда взаимодействующие молекулы способны к поляризации или имеют большие дипольные моменты. Последним условиям удовлетворяют многие гистохимические красители, содержащие большую ароматическую часть, а также такие компоненты биополимеров, как остатки ароматических аминокислот и гетероциклические основания нуклеиновых кислот. Таким образом, изменения размеров ароматической части в молекулах красителей могут сильно влиять на окрашивание.

Многие красители и биополимеры являются ионами, поэтому важную роль в их взаимодействии играют кулоновские силы. Поскольку эти электрические силы зависят от рН или от концентрации нейтрального электролита, то, варьируя названные параметры раствора, можно регулировать окраску препаратов ионными реактивами.

Некоторые способы окраски основаны на взаимодействии красителя и препарата с образованием водородных связей.

В водных растворах на это взаимодействие будет накладываться образование водородных связей с молекулами воды, так что, хотя данные связи и являются сильными, их общий вклад в сродство красителя и препарата неясен.

В отличие от водородных связей значение наиболее сильных взаимодействий краситель—препарат, а именно ковалентных связей, очевидно. При некоторых методах окрашивания происходит образование и разрушение ковалентных связей, в результате чего компоненты препарата превращаются в окрашенные производные; в других методах используется введение окрашенных меток в определенные участки молекул. Характер ковалентных связей различен. Те из них, в которых участвуют ионы металлов, являются очень полярными, и красители, действующие на основе таких взаимодействий, иногда называют в гистохимической литературе «протравой».

II. Взаимодействия краситель—краситель. Сродство препарата к красителю может возникнуть в результате такого взаимодействия, даже если при этом нет прямой реакции взаимодействия между красителем и препаратом. Ионные кристаллы сульфида свинца, откладывающиеся в местах активности ферментов, нерастворимы в воде и в спирте благодаря сильным кулоновским взаимодействиям между катионами свинца и анионами сульфида. Биологические препараты в данном случае просто выполняют роль матрицы, содержащей уже сформировавшиеся кристаллы. Другим примером такого рода является отложение металлического серебра при импрегнации. Сюда же относятся метахроматическое окрашивание и гистохимическая методика выявления ферментов с помощью азокрасителей, так как при этом для получения окраски используется взаимодействие красителя с препаратом или красителей между собой.

III. Энтропийные эффекты. Еще одним примером сродства, не связанного непосредственно с взаимодействием красителя с препаратом, является гидрофобное связывание. Этот процесс зависит от энтропии и происходит только в водных растворах. Он состоит в том, что гидрофобные молекулы реактива включаются в гидрофобные биологические структуры, что сопровождается разрывом водородных связей между молекулами реактива и воды. Поскольку гистохимическое окрашивание представляет само по себе двухфазный процесс, то распределение красящих реактивов между раствором и препаратом зависит от энтропии.

Из объяснения, данного выше, не следует делать вывод о том, что избирательное окрашивание происходит только за счет эффектов сродства. На практике число мест связывания красителя так же важно, как и сродство красителя к реактиву. Кроме того, окрашивание часто производят быстро, поскольку, с одной стороны, это удобно, а с другой — биологические препараты часто нестабильны. В результате равновесие при окрашивании достигается далеко не всегда, и избирательность окрашивания часто обусловлена скоростью окраски.

Зависимость избирательности от скорости окраски

Эффекты, обусловленные скоростью окрашивания, можно использовать для получения избирательной окраски, однако они могут проявляться и неожиданно, давая артефакты.

I. Скорость диффузии. Диффузия может ограничивать либо скорость проникновения веществ в различные компартменты неокрашенного препарата («прогрессивное окрашивание»), либо скорость выхода веществ из различных компартментов окрашенного препарата («регрессивное» или «дифференциальное» окрашивание).

Дифференциальная проницаемость различных компартментов в биологических препаратах обусловлена многими факторами. Плотные структуры или структуры с большим содержанием поперечно сшитых либо слабо гидратированных полимеров обычно мало проницаемы, и наоборот. На скорость диффузии также влияет процесс приготовления препарата. Фиксация, вызывающая образование поперечных сшивок между белками, например фиксация глутаровым альдегидом, снижает скорость диффузии. Напротив, на некоторых стадиях процесса приготовления препарата может увеличиться степень дисперсности биологического препарата. Замораживание/высушивание, коагулирующие фиксаторы, обезвоживающие агенты, такие, как спирт, и заливка в парафин, — их применение может привести к повреждению клеток и тканей, к увеличению площади поверхности и вследствие этого к возрастанию проницаемости. Кроме того, скорость диффузии зависит от общей конфигурации препарата. Быстро окрашиваются монослои уплощенных клеток, подготовленные для цитологической или гематологической диагностики, а также тонкие срезы, полученные с твердых блоков ткани на криостате или с залитых в парафин блоков, которые красят после удаления парафина. Напротив, медленно окрашиваются срезы материала, залитого в пластик, а также толстые парафиновые или криостатные срезы, изготавливаемые для нейроанатомических исследований.

На скорость диффузии влияет также молекулярная структура красителей. Проще всего учесть влияние размеров: чем больше молекула, тем медленнее она диффундирует. Макромолекулярные вещества, такие как меченые антитела, в основном не проникают в живые клетки и в пластиковые срезы. Даже у красителей с гораздо меньшими размерами молекул обнаруживается сильно замедленная скорость диффузии, если их молекулярный или ионный вес превосходит несколько сотен дальтон.

Другим существенным фактором является сродство реагента и ткани. Только вещества с низким сродством могут быстро диффундировать. Синергидного усиления избирательности окраски можно добиться, используя для окраски препарата, содержащего структуры с различной проницаемостью, два красителя с разными по размерам молекулами. Классическим примером такой системы окрашивания является трехцветный метод (окраска по Маллори), при котором высокопроницаемые коллагеновые волокна избирательно окрашиваются кислыми красителями с крупными размерами молекул, а сравнительно малопроницаемая цитоплазма клеток — кислыми красителями с малыми размерами молекул.

Все методы, основанные на различиях в диффузии, чувствительны к способу фиксации, времени и температуре окрашивания, а также к другим факторам, влияющим на диффузию.

II. Скорость реакции. При некоторых методах импрегнации препарат сначала обрабатывают солью серебра, а затем восстановителем. Скорость восстановления должна быть не слишком велика, иначе все структуры покроются микрокристаллами серебра; но она не может быть и слишком низкой, иначе окраска вовсе не появится. Другой пример, можно найти в гистохимии ферментов: выявление кислой и щелочной фосфатаз. Эти ферменты хотя и гидролизуют одни и те же субстраты, но имеют различные оптимумы рН. Продолжительная инкубация с субстратом приведет к появлению окраски в местах локализации обоих ферментов вне зависимости от рН. И, наконец, последний пример — окрашивание периодатом—реактивом Шиффа. Оно включает в себя начальное окисление полисахаридов тканей, при котором в них образуются альдегидные группы, выявляемые затем с помощью реактива Шиффа. Избирательность окраски обусловлена быстротой реакции периодата с углеводами и более медленным окислением других биополимеров.

Катализ и другие способы воздействия на избирательность окрашивания

I. Каталитическое окрашивание. При некоторых видах окрашивания избирательность обусловлена тем, что в определенных участках препарата катализируются реакции, делающие эти места видимыми. Такой катализ может быть природным, а может быть индуцирован химически. Примерами первого типа являются ферменты: используя их специфические каталитические способности, можно превращать субстраты в окрашенные производные. В некоторых случаях визуализация достигается сразу, если подобраны подходящие субстраты, однако чаще для выявления фермента требуется инкубация препарата с соответствующим субстратом, а затем — превращение бесцветного промежуточного соединения в окрашенный конечный продукт с помощью визуализирующей реакции. Примерами таких методик служит выявление дегидрогеназ цикла Кребса. Препараты тканей инкубируют с соответствующими субстратами, при этом в местах локализации дегидрогеназ образуются протоны и электроны. Они улавливаются и визуализируются в результате реакции с солями тетразолия, в ходе которой образуется нерастворимый окрашенный пигмент — формазан. В рамках описанного подхода существует множество вариантов, позволяющих выявлять широкий круг ферментов.

Иногда участки каталитической активности создаются в результате химической обработки препарата. В качестве примера приведем метод выявления ионов металлов, присутствующих внутри клеток в очень низких концентрациях. Для этого металлы в первую очередь переводят в форму сульфидов. Сульфиды, даже имеющие окраску, присутствуют в слишком низких концентрациях, чтобы их можно было увидеть. Однако при использовании физических проявителей отложения сульфидов многих металлов катализируют восстановление Ag⁺ в металлическое серебро. Инкубацию препарата с солями серебра и проявителем можно продолжать до тех пор, пока в препарате не образуется достаточного количества металлического серебра, чтобы его можно было видеть.

П. Негативное окрашивание. Оно используется для выявления профиля поверхности образца и состоит в том, что краситель откладывается на поверхностях содержащихся в препарате структур. Как и при некоторых методах, упомянутых выше, здесь нет сил, обусловливающих взаимодействие красителя с препаратом. Негативное окрашивание позволяет хорошо выявлять внутри- и межклеточные каналы и канальцы, а также очертания клеток грибов или спирохет.

III. Прижизненное и флуоресцентное окрашивание. Если добавлять красители или флуорохромы к живым клеткам и тканям, то развивающаяся окраска в значительной степени отражает идущие в них физиологические и биохимические процессы. Классическим примером служит картирование распределения макрофагов в теле млекопитающих, выполненное с помощью красителя синего Эванса, который является индикатором фагоцитоза, поскольку накапливается во вторичных лизосомах. В настоящее время для подобных целей широко используются флуоресцентные красители, поскольку увеличение чувствительности, достигаемое при флуоресценции, позволяет понизить концентрации используемых реактивов и уменьшить токсическое действие красителей. Данный подход сейчас часто называют «использование флуоресцентных зондов». Он применяется для решения широкого круга проблем. Например, тест на жизнеспособность культивируемых клеток может быть основан на том, что интактные клетки не поглощают гидрофильные красители, но проницаемы для гидрофобных красителей. Другой функцией, которую можно тестировать, используя потенциал-зависимые флуорохромы, является нейронная активность в центральной нервной системе.

Что можно выявлять.

Выявление химических свойств