Водные фиксирующие смеси Фиксатор Навашина

хромовая кислота, 1%-й раствор - 10 частей;

формалин, 40%-й раствор от продажного - 4 части;

ледяная уксусная кислота — 1 часть.

Фиксирующая смесь после соединения компонентов быстро разлагается (формалин окисляется хромовой кислотой), поэтому фиксатор готовят непосредственно перед употреблением.

Фиксацию проводят в течение 24 ч, в темноте, при комнатной температуре. Фиксатор Навашина проникает в ткани не так хорошо, как спиртовые фиксаторы, поэтому приходится в большинстве случаев прибегать к вакуумной инфильтрации. Для этого открытые емкости с материалом в фиксаторе помещают в эксикатор, соединенный с вакуумным насосом, и оставляют на 5 или больше минут под вакуумом, чтобы избавиться от пузырьков воздуха и тем облегчить проникновение фиксатора, крупные объекты необходимо разрезать на мелкие части. После фиксации требуется тщательная, длительная (от 2 ч до суток в зависимости от величины и плотности объекта) промывка проточной водопроводной водой.

Фиксатор действует мягко, особенно хорошо сохраняет структуру ядра и хромосом. После фиксатора объекты хорошо окрашиваются ядерными красителями.

Фиксатор Флемминга (боннская смесь)

хромовая кислота, 1%-й раствор - 25 мл;

осмиевая кислота, 2%-й раствор — 5 мл;

ледяная уксусная кислота - 10 мл;

вода дистиллированная - 60 мл.

Материал фиксируют 1—2 сут. в темноте, затем промывают в проточной водопроводной воде в течение 4—24 ч в зависимости от размеров и плотности объекта.

Считается наилучшим из всех фиксаторов, которыми пользуются в микротехнике. Хорошо подходит для изучения структуры ядра и хромосом в процессе деления клетки. Многочисленные достоинства фиксатора объясняются крайне удачным сочетанием свойств веществ, входящих в его состав – действие уксусной кислоты, являющейся преимущественно ядерным фиксатором, дополняется действием осмиевой кислоты, проявляющей себя как цитоплазматический фиксатор; хромовая кислота, действующая как протрава, способствует поглощению объектом красителя.

Трудность фиксации жидкостью Флемминга заключается в том, что составные части ее с разной скоростью проникают в ткани, поэтому фиксируемые кусочки не должны быть толще 2—2,5 мм. Как и при фиксации смесью Навашина, эмбриологический материал должен быть тщательно отпрепарирован, расчленен на мелкие кусочки и подвергнут вакуумной инфильтрации.

Фиксатор Модилевского

хромовая кислота, 1%-й раствор — 9 частей;

уксусная кислота, 5%-й раствор — 2 части;

двухромовокислый калий, 5%-и раствор - 2 части;

формалин, 40%-й раствор от продажного — 2 части.

Компоненты фиксирующей смеси соединяют непосредственно перед фиксацией. Продолжительность фиксации 24 ч в темноте, затем следует промывка в проточной водопроводной воде в течение суток.

По действию на материал сходен с фиксатором Навашина: мягкий, хорошо сохраняет строение клеток.

Фиксатор Чиаччио

двухромовокислый калий, 5%-й водный раствор — 80 мл;

формалин, 40%-й раствор от продажного — 20 мл;

ледяная уксусная кислота — 5 мл.

Фиксируют в течение 1-2 сут с последующим хромированием в 3%-м растворе двухромовокислого калия в течение 2—3 сут, промывкой в водопроводной воде в течение суток и ускоренной проводкой до парафина. Хорошо фиксирует липоиды и частично жиры.

Глутаралъдегидный фиксатор (McDowell, Trump, 1976)

Готовится смесь из равных частей 4%-го формальдегида и 1%-го глутаральдегида, забуференных с помощью одноосновного фосфата натрия до рН 7,2—7,4.

Приготовленный фиксатор может храниться до использования в течение 3 мес. при 4°С.

Формальдегидный компонент фиксатора быстро проникает в ткань, тогда как медленнее диффундирующий глутаральдегид более основательно, чем формальдегид, фиксирует и надолго закрепляет ее. Объекты можно фиксировать целиком, не расчленяя на фрагменты. В отличие от большинства традиционно используемых в цитоэмбриологии фиксаторов после глутаральдегидной смеси нет необходимости сразу пускать материал в последующую обработку (промывка и т.д.): объект может храниться в фиксаторе длительное время (до 6 мес) без каких-либо признаков экстракции ядерно-цитоплазматического материала. После фиксации материал промывают буферным раствором (три смены по 1,5 ч), затем проточной или часто сменяемой водопроводной водой в течение часа и после проводки через спирты заключают в парафин.

Фиксатор обеспечивает хорошую сохранность внутриклеточных структур и при использовании различных комбинированных окрасок, применяемых в цитологии и эмбриологии, позволяет получить четкие картины строения клеток при микроскопировании. Хорошие результаты получаются и при проведении цитохимических реакций (реакция Фёльген—Шиффа на ДНК, реакция ШИК на полисахариды, реакции на ферменты и др.).

Фиксация материала, существеннейшим образом влияющая на сохранность внутриклеточных структур, является одним из первых моментов в сложной цепи процедур, ведущих к получению микроскопического препарата. Ошибки, допущенные при фиксации, не исправляются последующей обработкой материала и могут полностью обесценить результаты проведенного исследования. Помимо загубленного материала, бесполезно затрачиваются реактивы, труд и время, так как недостатки обнаруживаются позднее (при резке на микротоме, окраске или при микроскопировании препарата). Поэтому для успеха в работе, помимо правильного выбора фиксатора, необходимо тщательно соблюдать правила фиксации:

• Выбранный фиксатор должен соответствовать цели исследования.

• Фиксацию следует проводить сразу после взятия материала. Категорически недопустимо фиксировать заранее взятый материал.

• Операцию по фиксации проводить быстро: время между отделением фиксируемых частей от растения или животного и погружением их в фиксирующую смесь должно быть максимально сокращено.

• Фиксатор должен быть свежим, сохранять свой состав неизменным. Некоторые смеси хранятся долго, другие составляются непосредственно перед фиксацией вследствие их нестойкости.

• Любая фиксирующая смесь употребляется только один раз.

• При наличии нескольких вариантов рецептуры одной и той же фиксирующей смеси следует предпочесть более слабую концентрацию фиксатора и соответственно удлинить срок его действия на материал.

• Объем фиксирующей жидкости должен в 20-50 раз превышать объем материала, чтобы предотвратить сильное разбавление ее жидкостями фиксируемого объекта.

• Для ускорения проникновения фиксатора в объект последний должен быть соответственным образом отпрепарирован и расчленен на кусочки размером не более 3—5 мм³.

• Материал не должен плавать на поверхности фиксатора. Это наблюдается, когда в объекте есть воздух, препятствующий проникновению фиксатора. Показателем достаточного проникновения фиксатора служит погружение объекта в жидкость. Необходимо максимально удалить воздух из объекта. Это достигается интенсивным встряхиванием пробирки с фиксатором и объектом, но лучше поместить пробирку с материалом в эксикатор и откачать воздух вакуумным насосом.

• Оптимальная температура фиксации комнатная, так как при повышенных температурах во внутренних частях фиксируемого кусочка усиливаются процессы автолиза. В некоторых случаях можно проводить фиксацию «на холоду», т.е. в холодильнике или холодной комнате, но, разумеется, время фиксации при этом должно быть увеличено.

• Емкости для фиксации (пробирки, пузырьки и др.) должны быть с хорошо подобранными притертыми пробками, при этом для спиртовых фиксаторов резиновые пробки непригодны.

• На дно емкости для фиксации материала нужно положить тонкий слой стеклянной ваты или фильтровальной бумаги, чтобы объект со всех сторон смачивался фиксирующей смесью не касаясь дна сосуда.

• Строго соблюдать рекомендуемое время фиксации.

• Строго соблюдать точное этикетирование каждого образца и параллельное ведение ведомости (журнала) с подробной расшифровкой каждого номера.

• Строго соблюдать рекомендуемое время промывки материала после фиксатора.

Процедура фиксации

Заранее готовят плоскодонные пробирки, пузырьки или бюксы с притертыми крышками. Объем емкостей должен позволять произвести фиксацию каждого образца в достаточном количестве фиксатора. Из плотной бумаги (пергаментная бумага и калька непригодны) готовят этикетки размером 1—1,3 х 3,5—4 см. На этикетке простым карандашом средней твердости записывают порядковый номер фиксации, дату, название объекта, сокращенное название фиксатора. Этикетки укладывают в емкости для фиксации. Одновременно в журнале регистрации фиксаций (ведомости) делают подробную расшифровку каждого номера, который имеется на этикетках. Затем составляют фиксатор и разливают в емкости с этикетками (спиртовые фиксаторы можно приготовить заранее). Быстро обрезают острым лезвием или тонкими ножницами фиксируемые части и бросают их в емкость с фиксатором и этикеткой. В случае прилипания объекта к стенке емкости его сбрасывают в фиксатор при помощи стеклянной палочки. Далее удаляют воздух из объекта при помощи вакуумного насоса, закрывают образцы пробками и оставляют на время фиксации.

Хранение зафиксированных образцов

В состав многих фиксаторов входят токсичные вещества, длительное воздействие которых отрицательно сказывается на качестве исследуемого материала, вызывая чрезмерное уплотнение, хрупкость или мацерацию объектов. Поэтому после истечения срока фиксации, если фиксирующая смесь не обладает консервирующим действием, материал необходимо тщательно промыть, чтобы удалить остатки фиксирующих веществ. В зависимости от состава фиксатора исследуемый материал промывают либо спиртом (в случае спиртового фиксатора) соответствующей концентрации (такой, как в фиксаторе), либо проточной водой, если использовался водный фиксатор, либо буфером на котором готовился фиксатор.

После применения водных фиксаторов, таких, как фиксатор Навашина, смесь Флемминга, фиксатор Модилевского и др., промывать материал следует проточной водой от 1 до 4 ч; больше этого срока эмбриологический и цитологический материал промывать не рекомендуется, так как он хуже окрашивается. На скорость и качество промывки материала влияет температура воды.

Промывку объектов ведут в специальных цилиндрах высотой 4-5 см, сделанных из стеклянной трубки диаметром 1—2 см, обвязанных с двух концов марлей. Если нет стеклянных цилиндров, то материал можно поместить в марлевые мешочки, обвязав их ниткой. Исследуемый материал с этикеткой помещают в цилиндрах или марлевые мешочки, опускают в большой химический стакан, в который ставят воронку диаметром немногим больше диаметра стакана, и помещают под тонкую струйку водопроводной воды. Вода, попадая в стакан через воронку, непрерывно промывает материал, вытекая из носика химического стакана и через щели между стаканом и воронкой.

После фиксации в водных смесях образцы необходимо обезводить. Для дегидратации используются спирты возрастающей концентрации.

Готовится ряд разведения спиртов - 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, и помещают образцы, в зависимости от размера, на 0,5-2 ч в каждый из спиртов. Объем спирта, так же как и фиксатора, должен превышать объем образца в 20-50 раз.

После спиртовых фиксаторов промывку материала обычно осуществляют при помощи 70-80%-го спирта, выдерживая материал в нем в течение 1—2 ч. Как правило, делают это следующим образом: накрывают пробирку или пенициллиновый пузырек кусочком марли и осторожно сливают фиксатор, затем наливают первую порцию спирта; через 1—2 ч спирт осторожно сливают, затем наливают новую порцию, производят 3-4 смены 70%-го спирта, до исчезновения запаха уксусной кислоты, содержащейся в фиксаторах Карнуа, Чемберлена, «уксусном алкоголе» и др. Зафиксированный материал обычно оставляют на хранение в 70-80%-м спирте желательно в холодильнике.

В 70%-ом спирте большинство биологических объектов могут храниться достаточно продолжительное время (до 6 мес., и более).

Приготовление тонких слоев

Как уже говорилось, для того чтобы препараты можно было просматривать в световой микроскоп, они не должны быть ни слишком тонкими, ни слишком толстыми, т.е. из образца необходимо получить тонкий слой.

Тонкие слои приготавливаются разными методами. Наиболее простые (наименее трудоемкие???) методы включают в себя нанесение капель и приготовление мазков из жидкостей, получение мазков из мягких субстратов.

Препараты из биологических жидкостей (кровь, лимфа, спинномозговая жидкость, культуральная жидкость) изготавливают методом мазка, т.е. на предметное стекло наносят несколько капель исследуемой жидкости, и равномерно распределяют тонким слоем по предметному стеклу. Такой «размазанный» препарат, при необходимости окрашивают, заключают под покровное стекло и просматривают в микроскопе. Этим же методом можно изготавливать препараты из мягких или рыхлых тканей (костный и спинной мозг, растительный каллус).

Быстрое изготовление таких препаратов объясняет очень широкое применение их в клинической практике, но срок хранения таких препаратов, без фиксации (т.н. временные препараты), очень не большой (пока не высохнет жидкость, в которой находится объект ~ ½ - 3 ч).

Таким же способом изготавливаются прижизненные препараты (т.е. препараты, содержащие живые клетки) различных простейших, бактериальных клеток и др.

Жидкости с высоким содержанием клеток, как правило, перед приготовлением препарата разбавляют физиологическим раствором или буфером. Жидкости с низким содержанием клеток (моча или спинномозговая жидкость) необходимо сконцентрировать методом фильтрации через нитроцеллюлозный фильтр, и сделать отпечаток на стекле, или отцентрифугировать, и работать с осадком или с нижним слоем жидкости.

Рыхлые образцы необходимо суспендировать в буфере, а затем сделать мазок на поверхности стекла или отпечаток. Так же можно приготовит давленый препарат. Небольшой кусочек ткани помещают под покровное стекло, и аккуратно надавливая на покровное стекло тонкой палочкой (спичкой), раздавливают объект. При необходимости такие препараты можно окрашивать. Если объект суспендируется или раздавливается с трудом, то в таком случае производят мацерацию, т.е. обрабатывают его различными веществами, разрушающими клеточную стенку (как правило, это ферменты: целлюлазы, пектиназы и др., иногда применяют кислотный гидролиз, кипячение и т.д.).

Из плотных тканей изготавливают срезы. Изготовление срезов можно проводить из нативого материала, который отверждают путем замораживания, на криостате или, как в случае изучения различных древесин, при помощи остро наточенной опасной бритвы.

Но наиболее часто срезы получают на микротоме из препаратов, предварительно заключенных в твердую поддерживающую среду. Одна из самых распространенных методик состоит в заключение препарата в парафин.

Заключение объекта в парафин состоит в том, что всю внутреннюю водную среду ткани необходимо заместить теми веществами (т.н. промежуточные жидкости), в которых хорошо растворяется парафин. К таким веществам относятся многие неполярные растворители: бензол, толул, ксилол, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, диоксан и многие другие. Все эти вещества нерастворимы в воде, но хорошо растворяются в спиртах. Для, заключения в парафин в объекте необходимо сначала всю воду заместить спиртом, а затем промежуточной жидкостью. В процессе фиксации и при подготовке к хранению в 70% спирту так и так происходит частичная дегидратация образца. Поэтому после 70% спирта объекты переносят в

80% спирт на ~ 30 мин,

96% спирт (1) на ~ 30 мин

96% спирт (II) на ~ 30 мин

Долгое обезвоживание в 96% спирту не рекомендуется (не более 1,5 –2 ч), так как происходит вымывание липидов из образца.

После 96% спирта необходимо образец обезводить в 100% (абсолютном) спирте.

Абсолютный спирт готовится из 96% (если быть точнее, то при перегонке получается азеотропная смесь, которая содержит 95,5 объемных частей этанола и 4,5 воды) обработкой безводным сульфатом меди (CuSO₄). Для приготовления безводного сульфата меди (медь сернокислая) необходимо медный купорос (CuSO₄•7Н₂О) измельчить в ступке и осторожно прокалить в фарфоровой чашке при температуре не выше 200°С, не допуская побурения порошка. Для этого массу порошка все время перемешивают. Постепенно соль обезвоживается и приобретает почти белый цвет. После остывания ее используют для обезвоживания спирта.

Обычно на 1 л спирта берут 200—250 г сульфата меди. Его насыпают на дно банки с притертой крышкой и заливают 96%-ным спиртом. Обезвоженный сульфат меди поглощает воду в спирте и приобретает голубой цвет. Частично обезвоженный спирт переливают в другую банку со свежей порцией сернокислой меди. Обезвоживание повторяют несколько раз, до полного удаления воды из спирта. Об этом можно судить по цвету сернокислой меди: если соль при заливке спиртом сохраняет белый цвет, то в таком спирте нет больше воды, т. е. он стал абсолютным. Иногда порошок сернокислой меди насыпают в бумажные «гильзы» из фильтровальной бумаги и несколько таких «гильз» опускают на дно банки со спиртом, чтобы приготовить спирт без мути. Следует помнить, что абсолютный спирт, полученный таким образом, ядовит, так как содержит ионы меди.

Как мы уже говорили, парафин не смешивается со спиртом и водой, но хорошо растворяется в хлороформе, ксилоле, бензоле, толуоле и многих других полярных растворителях. В современной практике стараются не использовать хлорорганику, т.к. она слишком токсична. Используют обычно ксилол или бензол, и лишь в случае, когда необходимо ускорить пропитывание образца применяют хлороформ или дихлорэтан.

После 100 % спирта готовят несколько растворов спирта и промежуточной жидкости:

спирт 100% ксилол (бензол, толуол, хлороформ и т.п.)

3 части 1 части

1 часть 1 часть

1 часть 3 части,

и образец выдерживают в каждой смеси по 20-40 мин. Таким образом происходит замещение спирта в образце на промежуточную жидкость. Затем образец пропитывается не менее чем в двух сменах чистой промежуточной жидкости (в каждой 20-40 мин, зависит от размера объекта), для окончательного замещения спирта.

Приготовление парафина является очень важной частью всей работы по заливке образцов.

Парафин является смесью углеводородов. Температура плавления его может быть различной. Для гисто-, цито- и эмбриологических исследований лучше всего подходит парафин с температурой плавления 52—60°С.

В продаже имеется гомогенизированный парафин, выпускаемый в виде полупрозрачных белых плиток без примесей и пузырьков воздуха. Для работы хорошо иметь набор парафинов с различной температурой плавления, из которых можно составить парафин с нужной температурой плавления.

Гомогенизированный парафин перед употреблением расплавляют, выдерживают в таком состоянии в термостате один или несколько дней для того, чтобы улетучились нежелательные примеси. К тугоплавкому парафину прибавляют 5% пчелиного воска. Для хрупких объектов к парафину с температурой плавления 54-60° С добавляют, кроме воска, 5% стеарина.

Как правило, сразу готовят большое количество парафина, и подбирают количество пчелиного воска и стеарина опытным путем, т.е. наливаю парафин в формочку без образца, охлаждают и режут эту «пустышку» на микротоме. В том случае если срезы очень хрупкие и рассыпаются, то добавляют пчелиный воск, если блок очень мягкий и срезы сминаются, то необходимо добавить стеарин или парафин с высокой температурой плавления.

Перевод образца в парафин осуществляют следующим образом: объект переносят в небольшие фарфоровые тигли (или пенициллиновые пузырьки) с промежуточной жидкостью, уровень которой на 3—4 мм выше уровня объекта, туда же помещают столько же по объему измельченного парафина. Чтобы растворитель медленнее испарялся, тигли накрывают крышечками и помещают в термостат с постоянной температурой 56—57 °С.

Через сутки крышечки с тиглей снимают и материал выдерживают несколько суток (3-7) в термостате до исчезновения запаха растворителя, по мере испарения которого материал пропитывается парафином.

После полного пропитывания объектов парафином их вместе с расплавленным парафином и этикеткой разливают в формочки размером примерно 3 х 2 х 1 см, изготовленные из пергамента или плотной бумаги. Материал равномерно распределяют подогретой препаровальной иглой по дну коробочки. Этикетку, которая во время всей проводки перемещалась вместе с материалом, укладывают поверх застывающего парафина. Парафин быстро затвердевает, и образуются так называемые «пряники», содержащие внутри исследуемый образец, которые можно хранить неопределенно долгое время.

В некоторых случаях (Sam, 1983) используется проводка через изопропиловый спирт (ИПС). ИПС менее токсичен, чем ксилол или хлороформ, не вызывает хрупкости одревесневших тканей и не требует применения абсолютного этилового спирта. Материал проводят через этиловый спирт возрастающей концентрации (до 80%), затем через смесь равных частей 96%-го этилового спирта и ИПС, затем через три смеси чистого ИПС с парафином в соотношениях по объему 3:1, 1:1 и 1:3 соответственно. После этого материал переносят в чистый парафин и выдерживают в термостате до испарения ИПС.

В некоторых случаях, для ускорения процедуры пропитывания парафином применяют другую методику: готовят смеси парафина и хлороформа в соотношении:

парафин хлороформ

1 часть 3 части

1 часть 1 часть

3 части 1 часть, и образец выдерживают в каждой смеси по 1-2 часа. Происходит замещение промежуточной жидкости в образце на парафин. Затем образец пропитывается в двух сменах расплавленного парафина, причем в последней смене парафина необходимо оставить на ночь при 56—57°С. В этом случае вся пропитка осуществляется за 1 сутки.

Когда необходимо избежать полного обезвоживания, которое происходит при заливке в парафин, можно использовать в качестве поддерживающей среды водорастворимые заливочные среды. Водорастворимые заливочные среды предназначены в основном для проведения иммуноцитохимических и гистохимических реакций. Обезвоживание при их использовании может быть неполным или вообще не проводиться. Пропитывание может осуществляться водными растворами этих веществ.

Желатин

Желатин замачивают водой до сиропообразного состояния, несколько разжижают водой, помещают в нее маленькие кусочки материала и в течение нескольких часов пропитывают их этим раствором. После этого эти кусочки, ориентируя определенным образом, помещают на деревянные блоки, добавляют свежей, более густой желатины, и уплотняют ее в 10—20-процентном растворе формальдегида. При резке такого блока микротомный нож или ручная бритва смачивается водой. Полученные срезы отмывают от желатины теплой водой. Срезы освобожденные от желатины, могут быть окрашены обычным способом.(Прозина)

Полиэтиленгликоль

В тех же случаях, когда полное обезвоживание нежелательно, используют в качестве среды для заливки полиэтиленгликоль (ПЭГ). Для проводки необходимы полимеры с молекулярными массами 400, 1540 и 4000. После фиксации и промывки материала следует проводка последовательно через 10, 15, 20, 40 и 50%-й водные растворы ПЭГ с молекулярной массой 400 по 12 ч в каждом, затем его помещают в 70%-й раствор ПЭГ на 24 ч. После этого в раствор добавляют кусочки ПЭГ с молекулярной массой 1540 и оставляют на сутки в термостате при 37°С. Затем раствор заменяют расплавленной смесью ПЭГ с молекулярными массами 4000 и 1540 (1:5) и помещают в термостат при 56°С. В течение суток смесь 2—3 раза заменяют на свежую. После этого материал выливают в формочки, охлаждают и режут на микротоме.

Полимерные заливочные среды

Все большее применение в качестве заливочных сред находят различные полимерные смолы.

Парафин, желатин и полиэтиленгликоль имеют два основных недостатка:

1. При отвердевании происходит значительная усадка образца (при застывании парафина усадка составляет ~ 12% по объему, при высыхании желатин уменьшается в объеме до 15%). При таких больших показателях усадки происходит значительная деформация объектов, заключенных в эти заливочные среды,

2. Невозможность получения тонких срезов из материала, залитого в эти заливочные среды. Минимальная толщина парафиновых срезов ~ 3-5 мкм, желатиновых ~ 7-10 мкм.

Этих недостатков лишены различные пластические массы, которые широко применяются при приготовлении препаратов для электронной микроскопии. В последнее время методы, разработанные изначально для электронной микроскопии, находят все более широкое применение в подготовке препаратов для световой микроскопии.

Для получения тонких (1 мкм) и ультратонких (100-300 нм) срезов существует большой набор заливочных сред с различными свойствами. Это: эпоксидные смолы, эфиры акриловых кислот, полиэфирные смолы.

Из эпоксидных смол наиболее широко используются Эпон 812, Аралдит М, их смеси и смола Сперра. Эпоксидные смолы довольно гигроскопичны, и попадание в них влаги плохо сказывается на полимеризации. При полимеризации степень сжатия эпоксидных заливочных сред не превышает 2 %. При такой незначительной усадке морфология клеток практически не изменяется.

Эпоксидная заливочная среда состоит из мономера (Эпон, Аралдит), отвердителя и ускорителя. В качестве «отвердителей» (уплотнителей) — веществ, реагирующих с мономерами эпоксидных смол с образованием полимеров, используются ангидриды. Наиболее употребим додеценилсукциниловый ангидрид (ДДСА). Он имеет длинную молекулу и обеспечивает пластичность смолы после полимеризации. Реакция полимеризации между эпоксидной смолой и ангидридами требует очень высокой температуры. Для того чтобы реакция проходила в доступном температурном режиме, в смеси добавляют инициаторы (катализаторы).

При заливке в эпоксидные смолы материал, так же как и в случае с парафином, необходимо обезводить (как правило, спиртами), а затем пропитать промежуточной жидкостью (безводный ацетон или окись пропилена) в которой хорошо растворяются мономеры эпоксидных смол и затем заместить промежуточную жидкость пластмассой.

Акриловые смолы (метилметакрилат, бутилметакрилат, окиси гидрооксипропилметакрилата, гликольметакрилат, их смеси) при полимеризации дают достаточно малую усадка (менее 5%). Эти вещества являются более токсичными, чем эпоксидные смолы. Пары метакрилатов могут вызвать отравление при вдыхании; поэтому работать с метакрилатами необходимо в вытяжном шкафу. Чистый бутилметакрилат дает слишком мягкие для резки блоки, тогда как метилметакрилатные блоки слишком тверды. Эти два вещества можно смешивать в различных пропорциях и получать блоки различной степени твердости соответственно консистенции заливаемого объекта.

Для ткани средней твердости обычно применяется следующая пропись: 9 частей бутилметакрилата, 1 часть метилметакрилата, от 0,5 до 2% перекиси бензоила (катализатор). Перекись бензоила при 106° разлагается со взрывом, однако она относительно безопасна при комнатной температуре. После обезвоживания в спиртах (нельзя использовать ацетон и пропиленоксид, т.к. они блокирует полимеризацию) ткань пропитывают по следующей схеме:

Смесь спирта и метакрилата без катализатора, 1:1 30 мин

Смесь метакрилата без катализатора 60 мин с одноразовой

сменой этой смеси

Смесь метакрилата с катализатором 30 мин

Преполимеризованный метакрилат на ночь

После пропитывания образцы помещают в желатиновые капсулы и заливают свежим преполимеризованным метакрилатом. Полимеризация производится при освещении ультрафиолетовым светом в течение 1-3 сут.

Полиэфирные заливочные смолы (Вестопал W, Риголак, Селектрон-5003 и 5214) полимеризуются при температуре от 45 до 60°С или под воздействием ультрафиолетового облучения при комнатной температуре. При заливке не рекомендуется использовать полиэтиленовые капсулы. Наиболее широко применяется Вестопал W. Эти смолы не смешиваются с этанолом, поэтому обезвоживание обычно проводят в ацетоне или пропиленоксиде. Затем объекты инкубируют в растворах при возрастающей концентрации вестопала в ацетоне. Вестопаловые блоки относительно твердые.

Аквон — это бесцветная, гигроскопичная жидкость с низкой вязкостью, водорастворимая фракция, содержащаяся в коммерческом Эпоне 812, и смешивается с водой при t < 15°С. Он используется с теми же отвердителями и ускорителями, что и Эпон 812. Точный химический состав аквона неизвестен. Фиксированные и промытые объекты проводят через ряд водных растворов аквона с повышающейся концентрацией, постепенно достигая абсолютного аквона, который при добавлении уплотнителя и ускорителя полимеризуется и дает такие же блоки, как Эпон 812.

Разработаны и другие водорастворимые заливочные среды: дуркупан, гликольметакрилат, оксипропилметакрилат и новые акрилаты (LR Gold, LR White, Lowicrils) предназначены в основном для проведения иммуноцитохимических и гистохимических реакций.

Специальные способы заливки в парафин

Заливка в парафин очень маленьких объектов.

В том случае, когда необходимо сделать срезы мелких объектов (микроорганизмы, клеточные суспензии, пыльцевые зерна и т.п.) можно рекомендовать два способа обработки.

1. Все процедуры, начиная с фиксации необходимо проводить в конических центрифужных пробирках, и при смене растворов очень аккуратно убирать надосадочную жидкость. При медленном осаждении образца пробирку нужно отцентрифугировать несколько минут на небольшой скорости.

После застывания парафина основная масса образца сосредотачивается на дне пробирки. Для извлечения образовавшегося парафинового блока, конец пробирки помещают в горячую воду, и как только пристенный слой парафина размягчится, блок вытряхивают из пробирки.

2. Перед обезвоживанием в спиртах сконцентрированные образцы заключают в желатин или агарозу, и далее применяют стандартные методы обезвоживания и пропитывания описанные выше.

Заливка в парафин бесцветного материала.

Очень нежные ткани, пропитанные ксилолом и затем парафином, нередко становятся в последнем незаметными, благодаря чему их очень трудно или почти невозможно ориентировать при резке.

В таких случаях прибегают к окраске объекта спиртовым раствором эозина; после достаточной покраски материала его просветляют и т. д. Дальнейшей обработке эта окраска не мешает, так как срезы при проводке через спирт легко снова обесцвечиваются.

Приготовление блоков из парафинированного материала

Приступая к резке на микротоме, объект следует прикрепить к деревянному блоку или специальному столику микротома. Деревянные блоки представляют собой напиленные из сосновой или другой какой-либо древесины кубики, размером 3x3x3 см.

На торцовый конец блока прикрепляют парафиновую пластинку толщиной в 1,5 см. Сначала на поверхность блока следует поместить небольшой кусочек парафина, нагретым металлическим шпателем, расплавить его и на расплавленный парафин быстро перенести заготовленную парафиновую пластинку, наложить и прижать ее. Затем нагретым же шпателем обвести вокруг этой пластинки несколько раз. Расплавляясь, парафин заполняет образовавшиеся щели между деревянным блоком и парафиновой пластинкой. После охлаждения пластинка будет прочно держаться на деревяшке. На такой подготовленный блок укрепляют материал.

Можно предложить два способа прикрепления объектов к деревянному блоку или столику микротома.

Первый способ, наиболее простой. Парафиновый блок с объектом вынимают из формочки, и приплавляют к деревянному блоку, причем объект можно ориентировать определенным образом. После застывания производят обрезку лишнего парафина, оставляя вокруг объекта достаточный слой парафина. Обрезку лучше всего начинать сверху, после чего переходят к обрезке боковых сторон, так, чтобы смежные плоскости блока находились под прямым углом друг к другу. В противном случае при резке на микротоме будет получаться неправильная лента, закругляющаяся веером.

Не следует обрезать парафин вплотную к объекту, тогда срезы будут плохо склеиваться и не будет получаться лента.

Второй способ - «метод закапывания» по С. Г. Навашину. Этот метод более кропотлив, чем первый, но дает надежные результаты при заливке мелких объектов которые необходимо точно ориентировать.

Приводим последовательность работы при изготовлении парафиновых блоков «методом закапывания» (рис. 31).

Р абочую поверхность деревянного держателя нагревают над спиртовкой, затем на теплую поверхность наносят каплю жидкого парафина. Капля должна быть в центре и иметь максимальный диаметр. Высота ее обычно 3—4 мм (рис 31,1)

Далее монтируют объекты в капле парафина на деревянном держателе (рис31,2).

Постепенно подплавляют нагретым зондом парафиновую каплю со всех сторон и из пипетки обкапывают объект расплавленным парафином. Для этого расплавленный парафин накапывают небольшими каплями со всех сторон, а затем сверху. Чтобы парафин не сбегал, каждую новую каплю наносят на поверхность пленки блока(рис31,3).

Правильно залитый блок должен быть однородным, не слоистым, это удается, когда новые капли парафина наносят на жидкую, а не на застывшую поверхность блока. Закапывание продолжают до тех пор, пока объект не окажется внутри прозрачной капли, из которой при остывании не должны выступать кончики объекта.

Блок вместе с держателем опускают в холодную воду. После остывания его обрезают лезвием в форме правильного параллелепипеда (рис31,4) .

Микротом (от микро... и греч. tomē — рассечение, отрезок), инструмент для получения исследуемых под микроскопом тонких срезов с кусочков органов и тканей, залитых в парафин, целлоидин или замороженных. Первый микротом был сконструирован в 1-й половине 19 в. нем. биологом А. Ошацем — сотрудником Я. Пуркине. Существует два основных типа микротомов: объект укреплен в держателе и поднимается с помощью микрометрического винта, микротомный нож движется в горизонтальной плоскости (санный, рис. А); объект движется, нож неподвижен (ротационный, рис. Б).

Наиболее распространен салазочный микротом.

Получение срезов заданной толщины срезов в данном микротоме обеспечивается микрометрическим перемещением зажима с объектом в вертикальной плоскости.

Микротом работает по схеме: подвижный объект - подвижный нож.

Основными узлами микротома являются: станина, механизм автоматической подачи, механизм подъема, суппорт с держателем.

Станина 1 (рис.1) несет на себе все основные узлы и детали микротома. На ее боковой поверхности имеются две наклонные направляющие 2, по которым перемещается механизм подъема. На верхней части станины находится суппорт 6 с держателем 7. Внутри станины смонтирован механизм автоматической подачи.

Величина автоматической подачи устанавливается по шкале 3 (рис.1) путем совмещения соответствующей отметки с указателем 4. Автоматическая подача осуществляется следующим образом: при перемещении суппорта 6 в направлении шкалы 3 происходит перемещение стержня с укрепленной на нем собачкой. Собачка поворачивает храповик, который передает вращение микровинту 16 и перемещает по направляющим 2 механизм подъема

При обратном ходе суппорта пружина возвращает стержень и шкалу в исходное положение.

Заготовленный парафиновый блок, припаянный к деревянному кубику (что собственно и составляет блок), устанавливается между пластинами и зажимается ручкой 13.

Нож устанавливается в держатель 8 и закрепляется ручками 11.

Держатель 8 с ножом может быть повернут в держателе 7 на угол от 0 до 15°.Для ориентации поворота ножа на держателе 7 имеется отметка, а на держателе 8 - шкала. Цена деления шкалы 5°.

Кроме указанных двух типов микротомов, существует замораживающий, на котором режут объекты в замороженном состоянии. На столик такого микротома в каплю воды помещают объект и подают к нему углекислоту под давлением. Столик охлаждается, объект становится неподвижным в капле, после чего его можно резать. В некоторых случаях охлаждается углекислотой не только столик, но и нож. Метод замораживания применяют для диагностических, гистохимических, анатомических и других исследований. Здесь трудно получить тонкие срезы, а также непрерывную серию срезов, но зато он прост и требует немного времени.

Последовательность работы на санном микротоме.

1. Микротом очищают от пыли и парафиновых стружек, а движущиеся части смазывают вазелиновым маслом.

2. Подготовленный нож устанавливают под определенным углом наклона так, чтобы фасетка лезвия была параллельна граням парафинового блока и перпендикулярна направлению движения. Во время работы нож вытирают тряпочкой, смоченной в ксилоле.

3. Правильно закрепляют деревянный держатель с парафиновым блоком в объектодержателе, чтобы получались поперечные или продольные срезы. Нож и верхнюю поверхность парафинового блока осторожно сближают.

4. Устанавливают микрометрическим винтом необходимую толщину срезов в микрометрах. Она зависит от объекта и цели исследования. Так, для изучения митохондрий толщина срезов до 5 мкм, для подсчета числа хромосом в корешках 10—15 мкм, а при эмбриологических исследованиях 15—25 мкм.

5. Приступают к резке парафинового блока. Для этого при заднем положении ножа подают объектодержатель на толщину среза, например на 12 мкм. Тем самым парафиновый блок поднимается вверх к фасетке ножа на 12 мкм. После этого перемещают салазки с ножом к себе и срезают слой парафинового блока толщиной 12 мкм. Отодвинув назад салазки с ножом, снова подают объект при помощи микрометрического винта и передвигают салазки с ножом к себе. Так делают второй срез и т. д. В результате получается непрерывная лента срезов.

Во время работы необходимо обращать внимание на нож. Если он стучит, следовательно, его наклон недостаточен.

6. Срезы в виде ленты снимают с ножа мягкой кисточкой и укладывают в определенной последовательности на черную поверхность дна длинной, но неглубокой коробки, в которую помещают этикетку. Верхняя и нижняя поверхность ленты неодинаковы по внешнему виду: первая матовая, вторая — блестящая. Ленту укладывают в коробку, не переворачивая ее, т. е. блестящей стороной вниз. Микротом после работы необходимо очистить от стружек и поместить в футляр.

После этого приступают к наклеиванию срезов на предметные стекла.

Подготовка предметных стекол для наклейки парафиновых срезов

Полученные микротомные срезы должны быть наклеены на предметные стекла.

Для наклейки парафиновых срезов предметные стекла должны быть абсолютно чистыми, т. е. тщательно обезжиренными, что достигается тщательной промывкой их. Прежде всего предметные стекла моются с мылом в горячей воде, причем каждое стекло протирается с двух сторон специально отведенной для этого щеточкой. Затем их помещают в чистую кастрюлю с водой с моющим средством и кипятят в течение 1 часа, осторожно переворачивая стекла несколько раз так, чтобы их не поцарапать. После кипячения стекла следует хорошо промыть в холодной воде и поместить в насыщенный водный раствор двухромовокислого калия с крепкой серной кислотой (хромпик). В этой смеси стекла могут находиться неопределенно долгое время, но не менее 1 суток. Можно также, продержав стекла несколько дней в хромпике и хорошо промыв водой, хранить до употребления в банке с 96-градусным спиртом.

Банка должна быть закрыта хорошо пригнанной притертой пробкой.

На такие хорошо обезжиренные стекла можно наклеивать парафиновые срезы без белка или других каких-либо приклеивающих веществ.

Проверка чистоты стекла производится следующим образом: на обезжиренное стекло наносят несколько капель воды; если вода хорошо растекается, то стекло хорошо промыто. Если же на стекле следы жира, то вода собирается каплями, не растекается.

Наклейка парафиновых срезов на предметные стекла

При многократных промывках при окрашивании даже на чистых стеклах срезы часто смываются. Существует несколько различных методик нанесения на стекла покрытия, позволяющего улучшить адгезию.

А. Желатина—формальдегид. Часто используется при работе с замороженными срезами.

1. Смешайте 100 мл 1%-ной желатины (ее предварительно надо слегка подогреть, чтобы она растворилась) и 100 мл 2%-ного формальдегида.

2. Погрузите стекла в раствор на 3 секунды и дайте им высохнуть на воздухе.

3. Храните их при комнатной температуре и используйте по мере необходимости.

Б. Другая смесь на основе желатины. Иногда используется для замороженных и залитых в мягкую среду срезов.

1. Разведите 15 г желатины в 500 мл теплой воды.

2. Растворите 1 г алюмохромовых квасцов в 220 мл дистиллированной воды.

3. Смешайте два раствора, затем добавьте 70 мл ледяной уксусной кислоты и 300 мл 95%-ного этанола.

4. Храните смесь при комнатной температуре.

5. Покройте стекла, как указано в А, этап 2.

B. Альбумин. Обычно используется для срезов, залитых в парафин.

1. Растворите 2,5 г яичного альбумина и 0,25 г NaCl в 50 мл дистиллированной воды (нагреть до 37 °С).

2. Добавьте 50 мл глицерина и 0,05 г тимола.

3. Покрывайте стекла непосредственно перед употреблением.

Г. Поли-L-лизин.

1. Погрузите стекла в водный раствор (100 мкг/мл) поли-L-лизина с высоким молекулярным весом (Sigma).

2. Высушите и храните.

3. Для стекол, которые будут окрашиваться при реакции гибридизации ДНК in situ, концентрацию поли-L-лизина нужно увеличить до 1 мг/мл.

На подготовленные стекла необходимо нанести каплю воды, затем препаровальной иглой, смоченной в воде, переносят кусочки парафиновой ленты с одинаковым количеством срезов и располагают их в строгой последовательности в вертикальном или горизонтальном направлении. Затем стекло со срезами помещают на нагревательный столик. Вода, нагреваясь, расширяется и растягивает срезы, которые при этом расправляются. Как только срезы расправились, стекло следует снять с нагретой пластинки и остудить, после чего надо фильтровальной бумагой оттянуть воду.

Срезы уложить правильными рядами, плотно друг к другу, препарат хорошо просушить фильтровальной бумагой и поместить на специальный сушильный столик с температурой нагревания до 25°С, или в термостат с температурой в 30—35°.

Если лента с одного блока помещается на нескольких стеклах, то их необходимо нумеровать. Для этого нужно матировать концы предметных стекол по размеру этикетки при помощи очень мелкого наждачного порошка. Подписывать следует только простым карандашом.

Депарафинизация

Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стекла, непосредственно изучать под микроскопом трудно. Для выявления отдельных компонентов ткани необходимо срезы освободить от парафина, а затем окрасить. Последовательность работы следующая:

1) освобождение срезов от парафина ксилолом;

2) удаление ксилола путем замещения его на 96%-ный спирт;

3) удаление спирта промывкой срезов в воде;

4) протравливание с последующей промывкой (применяется не всегда);

5) окраска и промывка;

6) дифференцировка и промывка (применяется не всегда);

7) обезвоживание срезов в 96%- и 100%-ном спиртах;

8) замещение спирта па ксилол;

9) заключение в канадский бальзам.

Приведенная схема берется за основу при различных методах окраски постоянных препаратов, хотя и отличается деталями в зависимости от того, применяют один или несколько красителей, какой используется способ окраски, как проводится обезвоживание и т. д.

Канадский бальзам готовят, растворяя кристаллы бальзама в ксилоле до консистенции, напоминающей жидкий пчелиный мед.

Визуализация прозрачных объектов

Как уже было сказано ( ) подходящая толщина биологического материала для микроскопического исследования составляет несколько микрон. При такой толщине, без специальных приемов контрастирования, биологический материал, обычно не изменяет световой поток за счет поглощения настолько, чтобы достигалась контрастность изображения.

Контраст есть отношение разности между интенсивностью (степенью освещенности) фона (I_ф) и интенсивностью препарата (I_п) к интенсивности фона:

Контраст = (I_ф—I_п)/I_ф

Так, яркий белый объект на ярко освещенном фоне не будет давать никакого контраста и, следовательно, будет невидим. Не будет заметен и маленький темный объект на ярко освещенном фоне. Однако если препарат светлый, а фон черный, то контраст получается очень хороший. Методы получения контраста основываются на взаимодействиях света с веществом.

Можно выделить два основных способа повышения контраста биологических объектов: фазовый и амплитудный.

Первый - фазовый – когда свет проходит через неокрашенные, не поглощающие света объекты, структуры которых различаются по показателю преломления, а сами объекты отличаются от окружающей среды толщиной и показателем преломления. После прохождения света через эти объекты, амплитуда световой волны не изменяется, а изменяется фаза (приобретает т. н. фазовый рельеф).

Наш глаз различает изменения амплитуды световой волны (различие в поглощении света), но не различает изменений фазы световой волны (различий в преломлении света). Но с помощью специального оптического устройства можно преобразовать изменение фазы в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости (амплитудный рельеф), которые уже различимы глазом. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф.

Такой способ контрастирования в микроскопии называется фазово-контрастным и широко используется в настоящее время для наблюдения живых, неокрашенных биологических объектов.

Принцип метода. В заднюю фокальную плоскость (з. ф. п.) объектива вводится пластинка, создающая два эффекта: 1) изменение фазы света нулевого порядка дифракции по отношению к другим порядкам и 2) снижение интенсивности света нулевого порядка и в результате - уравнивание его с другими порядками. В современных микроскопах пластинка содержит кольцевое отверстие, которое отличается по толщине от остальной части пластинки и покрыто тонким слоем серебра для частичного поглощения светового потока от нулевого максимума.

Для того чтобы свет попадал в фазовое кольцо, в передней фокальной плоскости конденсора, то есть в плоскости, сопряженной с з. ф. п. объектива, устанавливается кольцевое отверстие.

При микроскопии образец всегда рассеивает свет, так что свет, прошедший через образец, имеет меньшую интенсивность, чем тот, который не проходил через него. Рассеяние света есть результат его дифракции и преломления, а также отражения и поглощения. В случае прозрачного образца рассеянный свет выходит из препарата с фазовыми сдвигами относительно нулевого максимума. Для монослоя клеток эта разность фаз составляет около четверти длины волны, а не ½ длины волны. При таком малом сдвиге фаз интерференция не будет достаточно сильной, чтобы изменение амплитуды было заметным для глаза. Фазово-контрастный микроскоп приводит эти фазовые сдвиги к такому уровню, который может дать различимую интерференционную картину.

Ф азово-контрастная микроскопия Bacillus Cereus на плотной питательной среде

Темнопольная микроскопия. При установке фазового контраста иногда может получиться сильное несоответствие между размерами прозрачного кольца конденсора и фазового кольца в объективе, что дает эффект темного поля, и тогда препарат виден в обратном контрасте. Темнопольное изображение создается рассеянным светом и, таким образом, представляет собой карту изменений коэффициента преломления и других светорассеивающих параметров препарата.

Принцип темнопольной микроскопии состоит в том, что свет нулевого порядка дифракции вообще не участвует в формировании изображения. Этот эффект может быть достигнут путем удаления нулевого порядка дифракции в з. ф. п. с помощью непрозрачного экрана. Конденсор микроскопа лучше при этом удалить и задавать апертуру падающего пучка непосредственно полевой диафрагмой, закрывая которую можно получить очень тонкий пучок света. Такой пучок легко перекрывается бляшкой, находящейся в з. ф. п. объектива. Изображение создается исключительно за счет рассеянного света и не содержит лучей нулевого порядка.

Однако обычно темнопольные условия наблюдения достигаются за счет того, что полностью перекрывается доступ в объектив для прямого света. Этот способ лучше, чем описанное выше использование темной бляшки в з. ф. п. объектива. Для этого используются специальные темнопольные конденсоры или универсальные конденсоры, имеющие специальное гнездо для установки экрана.

Лептоспира в темном поле (микрофотография)

Поляризационная микроскопия служит для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). К ним относятся многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отражённом свете.

Принцип метода. Световые волны колеблются во всех направлениях, перпендикулярных оси распространения луча. Плоскополяризованный свет представляет собой такой свет, колебания в котором происходят только в одной плоскости, перпендикулярной направлению распространения луча. Такой свет можно получить, отфильтровав от обычного света все колебания, за исключением того, которое происходит вдоль одного разрешенного направления. Для этих целей используется поляроид, который помещается перед осветительной системой (поляризатор). После объектива помещают другой поляроид (анализатор), находящийся в скрещенном либо параллельном положении относительно поляризатора. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). По таким изменениям можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

При скрещенных поляризаторе и анализаторе в темном поле зрения микроскопа видны темные, светлые или окрашенные анизотропные элементы объекта. Вид этих элементов зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации и от величины двойного лучепреломления.

Более точное определение оптических данных объекта делается с помощью различных компенсаторов.

Во многих случаях плоскополяризованный свет может быть полезен для повышения контраста и уменьшения освещенности фона. Когда свет отражается от поверхностей, плоскость его колебаний изменяется так, что становится возможным отсечь блики, удаляя при помощи поляризатора колебания в новых направлениях. Так же поляризованный свет используется в большинстве существующих интерференционных микроскопов, работающих с дифференциальным интерференционным контрастом, в некоторых интерферометрических микроскопах.

Получение контраста интерференционными методами

Дифференциальный интерференционный контраст (DIC)

Наиболее популярный метод достижения контраста, используемый сейчас даже чаще, чем фазовый контраст, - это интерференционный контраст по Номарскому. Он уже давно применяется в материаловедении, где часто используется падающий свет, а теперь метод Номарского быстро вытесняет фазовый контраст в биологических исследованиях.

Принцип метода состоит в том (рис. ), что луч плоскополяризованного света расщепляется призмой на два луча. Оба они проходят через объект очень близко друг к другу, однако достаточно далеко для глаза наблюдателя. За счет этого образуется разность длин оптического пути (р.о.п.) между двумя лучами, что создает эффект объемности за счет различий в интенсивностях освещенности деталей в конечном изображении. Два луча совмещаются второй призмой Волластона, расположенной в з.ф.п. объектива. Анализатор завершает формирование изображения. Два луча имеют боковой сдвиг друг относительно друга, и направление сдвига воспринимается как направление подсветки изображения с одной стороны (рис. 2.7, А).

Н а рис. 2.4.А показан ход лучей. Обратите внимание, что вторая призма Волластона подвижна относительно первой, что дает возможность настройки микроскопа. Разность длин оптических путей двух лучей обычно устанавливается так, чтобы получился так называемый нулевой серый фон, на котором объект будет ограничен соответственно светлой или темной каймой

Микроскопы, работающие в падающем свете, имеют лишь одну призму Волластона, которая служит одновременно для освещения и в качестве призмы объектива.

В DIC-микроскопе скрещенные поляризаторы расположены по ходу лучей, так что любое двулучепреломляющее вещество в препарате при определенной ориентации будет ярко светиться.

Обычная световая микроскопия	Фазово-контрастная микроскопия	Дифференциальная интерференционная микроскопия

И нтерференционный контраст по Жамину — Лебедеву основан на интерференции двух световых лучей, вышедших из одного источника. Можно получить дополнительную информацию о препарате, если пропустить один луч через препарат, а другой мимо него, и затем сравнить их.

Два луча можно совместить, в результате чего получается фон, состоящий из интерференционных полос, которые могут быть интерпретированы как серия контурных линий, обозначающих длины оптических путей, либо одну из полос можно расширить так, чтобы получить «плоский» фон. Препарат искажает картину полос. При монохроматическом свете он дает различную освещенность, а при освещении белым светом - отличную от фона окраску. Сдвиг полос, изменение интенсивности либо окраски могут быть соотнесены с разностью длин оптических путей (сдвиг = толщина Х относительный коэффициент преломления) и использованы для вычисления таких параметров, как толщина пленки или масса ядра, непосредственно в живой клетке.

Микроскопы могут различаться по способу разделения лучей в них. Некоторые из них отводят луч вбок (рис. 2.4, Б). Тогда лимитирующим фактором для микроскопии является размер отдельного объекта, который не должен превосходить расстояния между лучами. Другие микроскопы имеют систему с двумя фокусными расстояниями и поэтому не имеют указанного выше ограничения. Как показано на рис. 2.4, в этих микроскопах используется поляризованный свет, причем поляризаторы служат для расщепления луча и последующего совмещения двух лучей.

Интерференционная отражательная микроскопия

Интерференционная отражательная микроскопия - это метод для исследования ширины промежутков между двумя оптически прозрачными структурами. Если предположить, что одна из поверхностей плоская, то можно исследовать и даже измерить топографию второй. Данный метод был введен в биологию в 1964 году.

Физические основы метода понятны из рис. 2.5. Свет отражается от каждой границы, где происходит изменение коэффициента преломления, например, от границы между стеклом чашки и налитым в него раствором, а также от границы между клеткой и культуральной средой. Таким образом, свет, падающий под прямым или близким к прямому углом на границу раздела фаз стекло — вода, а затем на границу раздела вода — плазмалемма, дает две отраженные волны, различающиеся по фазе. Эти две отраженные волны, поскольку они имеют разные фазы, будут давать интерференционную картину.

Рис. 2.5. Интерференционная отражательная микроскопия. А. Диаграмма хода лучей. Штриховая линия обозначает падающий свет; пунктирная линия — отраженный пучок света. Падающий и отраженный пучки света не вполне идентичны, но разница между ними слишком мала, чтобы отразить ее на рисунке. Б. Детали препарата: I — падающий свет; R₁ и R₂ - свет, отраженный от границ раздела покровное стекло—среда и препарат—среда соответственно; d — расстояние между поверхностью клетки и покровным стеклом; п — показатель преломления стекла, заливочной среды, препарата и т. д.

Второй способ контрастирования прозрачных объектов - амплитудный – когда происходит поглощение света структурами препаратами, которые можно наблюдать с помощью микроскопа плоского поля проходящего света. При прохождении света через окрашенные участки препарата амплитуда световой волны уменьшается и эти участки видны как более темные, по сравнению с соседними неокрашенными участками.

Как уже говорилось, многие детали исследуемых объектов трудно или вовсе не различимы в поле зрения микроскопа и не столько по причине недостаточной разрешающей способности прибора, сколько вследствие недостаточной контрастности изображения объекта. Это привело к тому, что уже в позапрошлом веке, когда еще не были известны методы фазово-контрастной микроскопии, для усиления контрастности изображения стали применять кармин (1849 г.), гематоксилин (1865 г.), эозин, метиленовый голубой (1875 г.) и другие красители. Число красителей, применяемых в микроскопии для указанной цели, достигает в настоящее время более 200 наименований. К этой группе химических препаратов относятся также витальные красители и флуорохромы.

В современных исследованиях методы изучения живого материала, основанные на использовании витальных красителей (т.е. окрашивание живых клеток не токсичными, или малотоксичными красителями), были вытеснены оптическими методами, такими как фазовый контраст, DIC-метод и др., однако в случае фиксированных препаратов, из которых изготавливаются тонкие срезы, окрашивание является основным способом визуализации.

Процесс окрашивания можно рассматривать как нанесение видимых меток на интересующие объекты. Использование для получения контраста красителей с поглощающими хромофорами основано на том, что красители связываются с теми или иными структурами препарата, характеризующимися своим физико-химическим свойствам.

Для каждого объекта выбирают свой метод окраски в зависимости от цели исследования и фиксатора. Различные структуры в клетке неодинаково воспринимают и удерживают красители. Все известные красители по своему происхождению делят на три группы: растительного или животного происхождения и синтетические. Последние, в свою очередь, делят на основные, кислые и нейтральные.

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа:

Кислые красители - кислоты и кислые соли (эозин, кислый фуксин и др.) - окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).

Основные красители - основные соли (гематоксилин - точнее, продукт его окисления – гематеин, азур 2, кармин, генциановый фиолетовый и мн.др.) - окрашиваемые структуры называются базофильными (сродство к основным красителям). Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами - ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.

Нейтральные красители - смесь двух красителей например: основного (азур 2) и кислого (эозин). Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином (пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах), а ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.

Иногда выделяют индифферентные красители - судан III, судан IV и др. Суданом окрашиваются жировые капли, в которых он хорошо растворяется.

Для изучения общей морфологии ткани имеется много различных методик. Ввиду огромного количества различных красителей и их комбинаций мы приведем здесь наиболее употребительные как в анатомической, так и цитолого-эмбриологической практике.

Сафранин. Один из самых употребительных красителей в анатомической микротехнике. Особенно хорошо окрашивает ткани после спиртовой фиксации и после фиксации смесями, содержащими хромовую или осмиевую кислоту.

Чаще употребляется 1—2-% водный раствор красителя.

При окраске ядер лучшие результаты дает раствор сафранина, приготовленный следующим образом: растворяют 1 г красителя в 100 мл абсолютного спирта, а затем разбавляют водой вдвое, т. е. получается 0,5-процентныи раствор в 50° спирте.

Также можно рекомендовать раствор сафранина, приготовленного по способу Картиса: растворить 2 г красителя в 100 мл воды, сюда прибавить 0,25 г поташа и затем налить 1/3 хлороформа от всего количества. Хорошо взболтать; сутки дать постоять, слегка накрыв сосуд, в котором готовился краситель, чтобы хлороформ мог постепенно испаряться — после чего отфильтровать. Если запах хлороформа сохранился, то слегка нагревают до полного исчезновения запаха.

Окрашивание длится от 5—10 мин. до 24 ч в зависимости от объекта. Срезы сначала промываются водой, затем спиртом.

Хорошо комбинируется с водным синим или светлым зеленым.

Сафранин на анилиновой воде. 1 г сафранина растворяют в 10 мл 96^О спирта, затем добавляют 90 мл анилиновой воды. Для получения анилиновой воды к 100 мл воды добавляют 5 мл анилина, смесь хорошо взбалтывают, затем фильтруют. Срезы держат в красителе от 24 до 48 ч, после чего промывают в воде с добавлением соды. Дальнейшая промывка и обезвоживание производится подкисленным 96^О спиртом, затем чистым 96^О спиртом. Из спирта срезы перенести на 3—5 мин. в раствор генцианового фиолетового, который приготовляется следующим образом: 1 г красителя растворяют в 10 мл спирта, добавляют 90 мл анилиновой воды (так же, как и в сафранин).

Срезы после генцианового фиолетового промывают спиртом и помещают в раствор йода в йодистом кали на 1—3 часа. Срезы после этого становятся черными.

Дальнейшая дифференцировка и обезвоживание производятся 96^О спиртом, затем срезы просветляются ксилолом и заключаются в канадский бальзам.

Красители с анилиновой водой плохо сохраняются. Хранить их следует в темном месте.

Окраску сафранином можно комбинировать с окраской водным синим.

Водный синий (анилиновый голубой водорастворимый). Употребляется в виде 1% водного раствора, но дает в этом случае довольно грубое синее окрашивание.

Более приятные оттенки голубого цвета неодревесневших оболочек растений дает водный синий, приготовленный следующим образом: берется насыщенный раствор пикриновой кислоты в 50^О спирте, в него добавляется сухой краситель до желаемого оттенка. Если желательно получить тон густой синий, то прибавляют больше, если более правильный голубой, то берут меньше.

Вносить краситель в раствор пикриновой кислоты следует небольшими порциями, следя за оттенком раствора или пробуя окрашивать срезы.

Такой же раствор можно приготовить несколько иначе: готовят не очень крепкий водный раствор водного синего или растворяют краситель в 50° спирте, и к нему добавляют раствор пикриновой кислоты до получения раствора желаемого оттенка. Окрашивает очень быстро, 0,5—1 мин. После окраски производится дифференцировка с одновременным обезвоживанием срезов 96° спиртом. Хорошо комбинируется с сафранином.

Оранж G. Можно пользоваться этим красителем как в виде 1-% водного раствора, так и 1-% спиртового; чаще всего, однако, употребляется насыщенный раствор этого красителя в гвоздичном масле (что приблизительно соответствует 1-% раствору).

Употребляется оранжевый G при тройной окраске в комбинации с сафранином и водным синим. При окрашивании стебля в этом случае в желтый цвет оранжем окрашивается колленхима и неодревесневшие лубяные волокна, в красный цвет сафранином окрашиваются древесные, в голубовато-зеленый водным синим окрашивается флоэма и основная паренхима.

Эозин. Применяется как в виде 1% водного раствора, так и в виде 1% раствора в 70% спирте. Дает хорошие результаты в комбинации с метиленовым синим.

В отдельных случаях пользуются эозином, растворенным в гвоздичном масле. Хорошо окрашивает слизи. Применять следует после обезвоживания срезов спиртом 100°, а перед заключением в канадский бальзам раза 2 —3 промыть ксилолом.

Эозин в гвоздичном масле или спиртовой раствор (1-% в 96° спирте) часто применяется как дополнительная окраска для эмбриологических срезов в комбинации с окраской гематоксилином по Гейденгейну или по Деляфильду, или по Равицу.

Генциановый фиолетовый. Чаще всего употребляется в виде 1% водного раствора. Водным раствором красителя хорошо окрашиваются в лиловый цвет одревесневшие оболочки. Прекрасно красит в лиловый цвет крахмальные зерна, особенно, если во время окрашивания слегка подогреть препарат.

Менее употребительным является раствор генцианового фиолетового, приготовленный по способу Грама на анилиновой воде следующим образом: на 100 мл воды берется 3 г анилина, 1 г красителя и 15 мл спирта 96°. Употребляется при окраске алейроновых зерен и бактерий. Этот раствор очень непрочен.

Иногда употребляют раствор генцианового фиолетового в гвоздичном масле.

Для окраски цитологического и эмбриологического материала применяется окраска генциановым фиолетовым по Ньютону. Препараты помещают в 1-% водный раствор красителя, где он остается от 3 мин. до 1 часа. После окрашивания препарат на секунду следует окунуть в раствор йодистого кали (1 г йодистого кали и 1 г йода растворить в 100 мл спирта 70°). Затем прополоскать препарат в 96° спирте, перенести в 100° спирт, после чего поместить в чистое гвоздичное масло или в гвоздичное масло с добавлением оранжа или эозина для дополнительной подкраски. Так как гвоздичное масло дифференцирует генциановый фиолетовый, то необходимо следить за ходом дифференцировки под микроскопом. Дифференцировка идет очень быстро. После окончания ее, следует тщательно промыть препарат в ксилоле и заключить в канадский бальзам.

Гематоксилин. В микротехнике, помимо перечисленных выше синтетических красителей, так называемых анилиновых, большое применение имеет гематоксилин — краситель растительного происхождения, который приготовляется из древесины кампешевого дерева (Haematoxylon campechianum), который образует при окислении сильно красящее вещество — гематеин.

Существует большое количество различных способов изготовления этого красителя. Мы приведем здесь только некоторые из наиболее употребительных в анатомической, эмбриологической и цитологической практике.

Гематоксилин по способу Деляфильда: к 100 мл насыщенного раствора аммиачных квасцов в воде прибавляют 1 г гематоксилина, растворенного в 6 мл абсолютного спирта. Ставят эту смесь на неделю на свет в сосуде, слегка прикрытом сверху для доступа воздуха. Затем фильтруют и добавляют 25 мл химически чистого глицерина и 25 мл метилового спирта. Не ранее чем через 4 часа после этого фильтруют снова.

Этот раствор созревает в течение 2 месяцев и больше, и все это время он должен находиться на свету, после чего он становится годен к употреблению. Долгое выдерживание гематоксилина на свету необходимо для того, чтобы путем окисления гематоксилин перевести в гематеин. Чемберлен указывает, что процесс созревания может быть ускорен подогреванием.

Раствор сохраняет годность в течение многих лет, но при условии хранения его в темной склянке и в темноте. Перед употреблением обычно его разбавляют дистиллированной водой (приблизительно на 100 мл воды 30 мл красителя). Если раствор окрашивает слабо, то красителя можно добавить; крепость раствора приходится варьировать в каждом отдельном случае.

Окраску необходимо контролировать под микроскопом: как только клетки достигнут желательной интенсивности, раствор сливают, а срезы ополаскивают водой.

В качестве дополнительных окрасок для одревесневших элементов можно воспользоваться окраской сафранином. Дифференцировка и обезвоживание производятся 96° спиртом; полное обезвоживание — абсолютным спиртом, затем, как обычно, проводят через ксилол и заключают в канадский бальзам.

Гематоксилин Майера: 0,5 г гематоксилина растворяют в 500 мл воды; к раствору добавляют 0,1 г йодноватокислого натрия (NaJO₃) и 25 г калийных квасцов. Встряхивают смесь, пока не растворятся квасцы, затем добавляют 25 г хлоралгидрата и 0,5 г лимонной кислоты — для лучшей сохранности его. Раствором можно пользоваться через несколько часов после приготовления. Употребляется в тех же случаях, как и гематоксилин Деляфильда.

Гематоксилин. Карацци: смешивают при комнатной температуре 0,5 г гематоксилина, 25 г калийных квасцов, 100 мл химически чистого глицерина с 400 мл воды; затем добавляют сюда 0,1 г йодистого калия. Через 2 часа краситель готов к употреблению.

Очень хорошо сохраняется. Употребляется так же, как оба вышеописанных красителя.

Гематоксилин Эрлиха: 2 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96° спирта, сюда добавляют 10 мл уксусной кислоты, 100 мл химически чистого глицерина, 100 мл воды и 3 г алюминиевых квасцов.

Оставляют стоять на свету пока смесь не примет темно-красную окраску, после чего краситель надо сохранять в хорошо закупоренной темной склянке и в темном месте.

Гематоксилин по Гейденгейну, или железный гематоксилин, употребляется для окраски цитологических и эмбриологических препаратов.

Приготовление: 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96° спирта; затем добавляют 90 мл дистиллированной воды, закрывают колбу ватой и оставляют на свету в течение 2—3 недель для созревания. После чего краситель готов к употреблению.

Перед употреблением краситель разбавляют дистиллированной водой вдвое, так что получается 0,5% раствор.

Процесс созревания можно ускорить подогреванием. Растворяют 1 г гематоксилина в 100 мл воды и подогревают раствор на водяной бане до полного растворения красителя, после чего два-три раза фильтруют раствор, который, остудив, можно употреблять.

Так как в гематоксилине часто развиваются микроорганизмы, то в раствор полезно внести небольшой кристаллик тимола.

Методика окрашивания железным гематоксилином следующая: препараты перед окрашиванием выдерживают в течение 6—12 час. в 4-% водном растворе железо-аммиачных квасцов, после чего промывают их 5 — 10 мин. водой, сменяя ее 3—4 раза, затем переносят в гематоксилин на 12-14 час.

Вынутые из гематоксилина препараты споласкивают в водопроводной воде и сейчас же начинают их дифференцировку, для чего каждый препарат отдельно помещают в 2-процентный раствор железо-аммиачных квасцов. Удобнее всего это делать в бактериологической чашке, так как дифференцировку ведут, контролируя ее все время под микроскопом. Как только станут отчетливо видны ядра, хроматин — препараты помещают в сосуд для промывки проточной водой. Промывают в течение 0,5—1 часа, затем обезвоживают как обычно, спиртами 96° и 100° и заключают в канадский бальзам.

Дифференцировку препарата квасцами очень удобно наблюдать, пользуясь объективом с водной иммерсией. Можно также контролировать этот процесс, вынув препарат из квасцов, ополоснув водой и нанеся каплю глицерина, накрыть покровным стеклом.

Раствор гематоксилина может служить долго, но необходимо следить за тем, чтобы не внести в него квасцов, отчего он темнеет и становится непригодным к употреблению. Кроме того, гематоксилин следует после нескольких раз употребления фильтровать, так как в нем часто появляется осадок или образуется плесень. Проверка качества гематоксилина, уже несколько раз использованного, может быть произведена простым способом. Налив в стаканчик несколько капель раствора гематоксилина, прилейте туда немного водопроводной воды. Если вода окрасится в чистый аметистово-лиловый цвет, то краситель пригоден к употреблению; если же окраска воды будет желтая или грязно-лиловая, то гематоксилин негоден и его следует заменить свежим раствором.

Существует ускоренный способ окраски железным гематоксилином, который заключается в том, что препараты в 4% квасцах на 30—40 мин. помещают в термостат с температурой 45—56°. Затем промывают их, как обычно, водой и, перенесенные в гематоксилин, ставят снова на тот же срок в термостат, после чего приступают к дифференцировке 2-% квасцами. Этот способ дает так же хорошие результаты. Его можно комбинировать с длительным окрашиванием в зависимости от времени, которым располагает изготовитель препарата.

Гематоксилин Равица: 1 г гематоксилина и 1 г алюминиевых квасцов растворяют в 65 мл воды и добавляют 35 мл глицерина. Оставляют зреть на свету 1 неделю, после чего краситель готов к употреблению.

Срезы можно предварительно протравить 4-% квасцами в течение 0,5—1 часа, сполоснуть водой несколько раз в течение 5 мин., затем перенести их в гематоксилин на 0,5—1 час. После окрашивания сполоснуть водой и дифференцировать 2-процентными квасцами, затем промыть срезы в проточной воде 5 минут. Обезводить и заключить в канадский бальзам.

Для лучшего просветления хорошо перед бальзамом срезы поместить в гвоздичное масло, после чего, тщательно промытые в ксилоле или бензоле, заключить в канадский бальзам.

Железный гематоксилин по Гейденгейну и гематоксилин Равица употребляются при изготовлении цитологических и эмбриологических препаратов.

В качестве дополнительной окраски можно воспользоваться 0,5-1-% раствором эозина в воде или 70° спирте. Срезы окрашивать от нескольких минут до 1 часа.

Быстро провести через 96°, затем 100° спирт ксилол и заключить в канадский бальзам.

Хорошим дополнительным красителем к гематоксилину Равица служит оранж G или эозин в гвоздичном масле (эозин G).

Аляун-гематоксилин : приготовляется в виде двух растворов.

I раствор: в 50 мл дистиллированной воды растворить 25 г калийных квасцов.

II раствор - в 25 мл 96° спирта растворить 0,5 г гематоксилина.

Оба раствора смешать через 3—4 дня и оставить зреть на свету в колбе, закрытой ватой, в течение месяца.

Прогрессивная окраска. После окрашивания препарат промывают водой и обезвоживают 96° и 100° спиртом. Затем споласкивают ксилолом или бензолом и заключают в канадский бальзам.

Гематеин. Так как основным красящим веществом гематоксилина является гематеин, то указанные растворы гематоксилинов могут быть заменены гематеином, изготавливаемым для лакокрасочной промышленности синтетическим путем.

Способ приготовления раствора следующий: 0,5 мл гематеина смешивают с 25 мл 90° или 96° спирта, затем берут 25 г калийных квасцов на 500 мл воды. Все смешивается и слегка подогревается до растворения квасцов. После охлаждения жидкость готова к употреблению.

***

Все указанные гематоксилины и гематеин хорошо и быстро окрашивают клетчатку, слизи, протоплазму, ядра.

Ввиду того что все гематоксилиновые окраски, кроме окраски железным гематоксилином, являются окрасками прогрессивными, не следует передерживать срезы в красителях. Перекрашенные срезы можно ослабить промыванием подкисленным спиртом.

Двойная и тройная окраска

Сафранин и водный синий. Из сложных окрасок в анатомии растений на первом месте следует поставить двойную окраску сафранина в сочетании с водным синим, как одну из наиболее быстрых, контрастных и очень прочных.

Сафранин и лионский голубой (анилиновый голубой спирторастворимый). Последний готовится так же, как и водный синий. Способ окрашивания такой же.

Как и в предыдущей комбинации, сафранин окрашивает все одревесневшие ткани, ядра и крахмал в красный цвет, водный синий и лионский голубой окрашивают все неодревесневшие в голубой цвет; так же ими окрашивается в голубой цвет протоплазма и хлоропласты.

Сафранин с гематоксилином При окрашивании срезов сафранином в комбинации с любым из вышеописанных растворов гематоксилина, кроме железного гематоксилина и Равица. Лучше всего начать с гематоксилина и держать в нем срезы до желаемого оттенка. Затем промыть водой и перенести их в сафранин.

В случае перекрашивания препарата гематоксилином их надо промыть слегка подкисленным спиртом.

Гематоксилин по Деляфильду со спиртовым раствором эозина. Эта комбинированная окраска хороша для животных тканей и эмбриологического материала.

Срезы в течение 2—30 мин. окрашивают гематоксилином Деляфильда, следя за окраской под микроскопом и доводя ее до желаемого оттенка.

Окрашенные гематоксилином препараты помещают в 1-% раствор эозина в 70° спирте на время от 1 до 24 час (лучше на 2 часа.) Под микроскопом препараты дифференцируют 96° спиртом. Следить за дифференциров-кой нужно по ядрышкам — все должно стать лиловым, а ядрышки рубиново-красными. Крахмал при этом окрашивается в розовый цвет.

После окончания дифференцировки препараты очень быстро ополаскиваются 100° спиртом, на 5 мин. помещаются в 100° спирт-ксилол (1:1), затем в чистый ксилол и заключаются в канадский бальзам.

Сафранин с любым из голубых красителей и оранжем G. При этой тройной окраске препараты обычным способом окрашиваются первыми двумя красителями Затем они обезвоживаются, после чего помещаются на 3—5 мин в раствор оранжа в гвоздичном масле, промываются один раз чистым гвоздичным маслом, переносятся в ксилол и заключаются в канадский бальзам. Применяется для окрашивания анатомических срезов.

Метиленовый синий или метиленовый зеленый и эозин. Берутся водные 1—2-% растворы метиленовой синьки или зелени, куда помещаются срезы на 1 сутки. Промывают водой и дополнительно докрашивают 1-% раствором эозина в течение 0,5. Промывают 96° спиртом, затем абсолютным; для просветления проводят через смесь спирта с ксилолом и чистый ксилол. Заключают в канадский бальзам.

Гематоксилин Гейденгейна с эозином (или эритрозином).

Применяется для окраски тканей, и выделения срединной пластинки.

Пропитывают срезы в 1-% железных квасцах в течение 1—3 часов. В течение 5 мин. осторожно промывают водой, затем помещают срезы в 0,5% раствор гематоксилина на 1—3 часа. Окрашивание можно ускорить подогреванием, помещая баночку со срезами в термостат. После окрашивания срезы прополаскивают водой и дифференцируют в 1—2-% квасцах до желаемого оттенка. Затем следует промывка водой от 15 мин. до 1 часа и обезвоживание в 70° спирте. Обезвоженные срезы окрашивают в спиртовом растворе эозина от нескольких минут до 1 часа. После окраски эозином производят обезвоживание спиртами, просветление ксилолом и заключают препарат в канадский бальзам.

Эта комбинация красителей очень прочная и очень удобная при детальном исследовании структур. Годна для микрофотографирования.

Гематоксилин окрашивает срединную пластинку, которая по цвету отличается от одревесневшей оболочки; последняя окрашивается в черный цвет. Целлюлоза и вообще все мягкие ткани окрашиваются в розовый цвет.

Гематоксилин по Эрлиху и сафранин. Рекомендуется как одна из лучших окрасок для древесин.

Срезы окрашивают сначала гематоксилином, пока они не примут пурпуровой окраски; промывают сначала водным раствором углекислого кальция или натрия, а затем дистиллированной водой. Из воды срезы переносятся на 1—2 часа в спиртовой раствор сафранина.

Из сафранина срезы переносят прямо в абсолютный спирт; быстро обезводив, срезы переносят в ксилол или бензол и заключают в канадский бальзам.

Цианин (холиновый синий) и эозин. Берут 1-% спиртовой раствор цианина и разбавляют его вдвое дистиллированной водой. Окрашивают препарат в течение 5—10 мин. Промывают сначала 96°, а затем абсолютным спиртом до полного обезвоживания срезов.

Затем препарат переносят в раствор эозина в гвоздичном масле. Последнее одновременно и окрашивает и дифференцирует.

Цианин хранится в виде спиртового раствора и только перед самым употреблением его разбавляют водой.

Цианин и конго красный. Срезы в течение 15 мин. окрашивают в 1-% растворе цианина в 96° спирте, после чего промывают их 96° спиртом. Затем помещают на 15 мин. в 5-процентный водный раствор конго красного со следами аммиака; снова промывают 96° спиртом, обезвоживают, просветляют ксилолом и заключают в канадский бальзам.

Цианин с эритрозином. Каждый из этих двух красителей употребляется в виде 1-% раствора в спирте 96°; раствор перед употреблением разбавляется пополам водой, так что окрашивание ведется в 0,5-% растворе (приходится цианин растворять в 96° спирте, так как он не растворяется в 50° спирте). После окрашивания в течение 5—10 мин. цианином, препарат ополаскивается в спирте 96° и 0,5-1 мин. окрашивается эритрозином.

После эритрозина следует промыть препарат спиртом 96°, затем 100° (быстро) и заключить в канадский бальзам.

Бази-фуксин (основной фуксин) и пикриновая кислота.

Срезы помещаются на 15 мин. и более в водный раствор фуксина. Затем на краткое время в раствор пикриновой кислоты по Альтману: 1 часть насыщенного спиртового раствора пикриновой кислоты и 2 части воды, срезы окрашиваются очень интенсивно и их следует хорошо промыть 96° спиртом, обезводить, просветлить и заключить в канадский бальзам.

В качестве дополнительной окраски можно воспользоваться гематоксилином Мейера или анилиновым синим, или метиленовым синим.

Генциановый фиолетовый с оранжем G. Срезы помещают в 1-% водный раствор геницианового фиолетового на несколько минут, споласкивают их водой и переносят в 1-% водный раствор оранжа. После этого срезы обезвоживаются спиртами, затем проводятся через ксилол и заключаются в канадский бальзам.

Можно также после окраски генциановым фиолетовым обезводить срезы в спиртах, до 100°, после чего поместить на 0,5—1 мин. в раствор оранжа в гвоздичном масле, затем промыть препарат ксилолом или бензолом и заключить в канадский бальзам.

Малахитовый зеленый и конго красный. Применяется для окраски эмбриологических объектов. Срезы помещаются в 3-% водный раствор малахитового зеленого или метиленового синего на 6 ч. и больше. После этого они промываются водой и переносятся на 15 мин. в 1-% водный раствор конго красного. Затем срезы снова промываются водой, потом 80° спиртом до тех пер, пока получится дифференцированная окраска. Быстро заменить 80° спирт абсолютным, затем абсолютным спиртом с ксилолом (1:1), ксилолом и заключить в канадский бальзам.

Гистохимия

На принципе избирательного связывания красителей с теми или иными структурами в тканях и клетках основаны гистохимические и цитохимические методы окрашивания.

Гистохимия - раздел гистологии, изучающий химические свойства тканей животных и растений, изменения свойств клеток в процессе развития, и обновлением зрелых клеток и тканей, выясняющий особенностей обмена веществ в тканях и клетках

Основной принцип гистохимических методик — связывание определённого химического компонента клеток с красителем или образование окраски в процессе реакции. С помощью разных гистохимических методов можно определить локализацию и количество многих веществ в ткани, их метаболизм, связи с субмикроскопической структурой, активность ферментов. Перспективным направлением является также иммуногистохимия. Наиболее точные гистохимические методы, позволяющие исследовать структуры клетки, называют цитохимическими.

Факторы, влияющие на равновесие, и эффекты сродства

Когда распределение красящего вещества между раствором и препаратом сдвинуто в сторону последнего, то говорят, что система краситель—препарат обладает большим сродством. На характер равновесного распределения влияют все компоненты системы: разумеется, большое значение имеют взаимодействия реактив—препарат, но часто существенны также взаимодействия друг с другом двух реактивов и даже растворителей. Примеры обычно встречающегося сродства будут кратко обсуждаться ниже.