7. Сканирующая лазерная микроскопия

Обычно в микроскопии изображения очень мелких структур получают путем освещения всего препарата и увеличения изо­бражения объективом. При использовании вместе с микроско­пом телевизионной камеры принцип получения изображения не изменяется — изображение также создается объектом, и лишь затем сканируется телекамерой. Фактически все методы скани­рования применялись в основном в весьма ограниченной обла­сти микрофотометрии — для определения величин поглощения, флуоресценции или отражения. Недавно техника сканирования была применена для создания высококачественных изображе­ний с помощью мощных и хорошо сколлимированных лазерных пучков. В оптической лазерной сканирующей микроскопии объект не освещается целиком, а сканируется шаг за шагом [17, 45—47]. В каждой освещенной точке измеряется прошед­ший, отраженный или испускаемый свет. Изображение создает­ся за счет накопления результатов этих измерений для каждой точки после их аналоговой или цифровой обработки, как матри­ца в памяти компьютера.

В приборе, имеющемся в нашей лаборатории (Zeiss, ФРГ), сканирование выполняется с помощью гальванометров с серво­приводами. Время сканирования сравнительно короткое (2 с на поле из 512x512 пикселов). Процесс сканирования контролиру­ется микропроцессором. В качестве фотодетектора используется ФЭУ. Его сигнал проходит через блок аналоговой обработки, который контролирует яркость и контрастность. После оцифров­ки этот сигнал попадает в буферную память, куда он записы­вается с видеочастотой. Соответственно стационарное изобра­жение на мониторе получается при условии, что во время счи­тывания столик стоит неподвижно. Плавно меняющееся увеличе-чение может быть получено с помощью блока переменного увеличения. Сканирующий лазерный микроскоп можно использовать как с обычным, так и с лазерным источником света. С помо­щью лазера можно получить как падающее освещение (для от­ражения и флуоресценции), так и проходящее освещение (для поглощения, фазового или дифференциального интерференцион­ного контраста). В качестве обычного источника света можно использовать только лампу накаливания, снабженную светово­дом. Для обеспечения лучшей фокусировки и возможностей поиска на препарате, а также для исследования препаратов с двойным окрашиванием, мы добавили к лазерному сканнеру обычный блок эпиосвещения. Принципиальными преимущества­ми лазерного сканирования являются:

1) низкий уровень аутофлуоресценции в оптическом пути, кото­рый достигается благодаря точечному освещению;

2) высокая чувствительность микроскопа, возникающая вслед­ствие использования мощного лазерного света, сфокусиро­ванного в точке. Можно наблюдать даже слабо флуоресци­рующие ДНК-зонды;

3) использование оптики с малым увеличением. Интенсивность флуоресценции достаточно высока, что позволяет работать с объективом Х2,5. Это является важным преимуществом при проведении исследований мозга;

4) низкий уровень выцветания, так как время освещения каж­дой точки очень короткое;

5) возможность проведения многофакторного анализа;

6) последовательное сканирование на разных уровнях при кон­фокальной сканирующей микроскопии.

Данный метод применяется в тех исследованиях, где надо работать с очень слабой флуоресценцией, например при прове­дении реакции гибридизации. Лазерная сканирующая микро­скопия много дала также для исследований мозга, поскольку она позволяет использовать оптику с малым увеличением, необ­ходимую при исследовании связей в нервных сетях. На рис. 6.10 представлены нервные клетки из гиппокампа крысы. Эти клетки были маркированы для выявления специфических молекул. По сравнению с нормальной флуоресцентной микроскопией контраст между изображением и фоном, получаемый с помощью лазерного сканирования, намного выше: здесь остается только очень низкий уровень нежелательного фонового свечения. С по­мощью лазерного сканирования реакцию можно также оценить количественно, поскольку данная техника позволяет установить порог между клетками и фоном для улучшения контраста изо­бражения, получаемого с препаратов с очень низким содержа­нием продукта реакции.

Кроме того, лазерное сканирование открывает новые воз­можности для исследования с помощью световой микроскопии

В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

Методика начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, называемых зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

• локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом,

• альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа,

• зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Образцы для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции ( в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов (c-myc/n-myc), связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.

Для проведения FISH помимо коммерчески доступных меченых специфических зондов и реагентов для проведения гибридизации требуется флуоресцентный (люминесцентный) микроскоп. Примером удобного и простого в обращении микроскопа являются микроскопы фирмы Nikon серий Eclipse Fluo E 200 F, 50i, TS 100/100 F, хорошо зарекомендовавшие себя при проведении анализов с помощью FISH в цитогенетических лабораториях.

Ресурс: Программа и методические указания к изучению курса БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ для студентов дневного, вечернего и заочного отделений биолого-почвенного факультета Язык: ru, статус: бесплатно Описание: Методы исследования клеток. Прижизненные наблюдения клеток. Культура клеток вне организма. Метод темного поля. Фазовоконтрастная микроскопия. Цейтраферная и рапид микросъемка. Микроманипулятор. Микрохирургия. Методы исследования физических свойств клеток. Суправитальная люминесцентная микроскопия. Витальные красители. Изучение фиксированных клеток. Понятие о фиксации. Артефакты при обработке клеток. Принципы окрашивания клеточных структур. Цитохимические качественные методы исследования: реакции на белки, ферменты, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды, витамины, соли и т.д. Иммунохимия. Аннотация: Ключевые слова: биология, клетка, метод темного поля, фазовоконтрастная микроскопия, цейтраферная микросъемка, рапид микросъемка, микроманипулятор, икрохирургия, микроскопия, фиксация, артефакты, иммунохимия