4.1.1. Прижизненное окрашивание флуорохромами

Для создания контраста при флуоресцентной микроскопии требуются очень низкие концентрации красителей, что позволяет использовать для визуализации живых клеток такие вещества, как акридиновый оранжевый. Некоторые компоненты клеток обладают собственной флуоресценцией, и в комбинации с кра­сителем это может давать полезную информацию. Пример тако­го окрашивания приведен в табл. 6.3. Использование акриди­нового оранжевого в качестве красителя для изучения живых трипаносом уже описывалось в гл. 1.

4.2. Иммунофлуоресценция

В иммунофлуоресценции используется специфическая реак­ция между антителом и антигеном. Антитела, или иммуноглобулины, образуются в организме животных и человека для за­щиты против чужеродных тел (антигенов), таких, как бактерии, вирусы и др. Антитела, меченные флуорохромами, называются конъюгатами (табл. 4.6 в гл. 4). Когда конъюгаты используют­ся в реакции антиген—антитело, место реакции можно видеть во флуоресцентном микроскопе вследствие отложения в нем продукта реакции. Реакция антиген—антитело очень специфич­на: антиген не реагирует с антителами, которые не соответству­ют его структуре. Можно также метить антигены для обнаружения антител. Наиболее известными флуорохромами, использующимися для мечения, являются ФИТЦ и тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ). Максимальное возбуждение для ФИТЦа приходится на синюю область спектра, что дает зеленую флуоресценцию (рис. 6.1). Для возбуждения ТРИТЦа используется зеленый свет, а продукт реакции дает красную флуоресценцию. Комбинации синих и зеленых возбуждающих фильтров для работы с эпиосвещением даны в табл. 6.2.

Иммунофлуоресцен-ция — это широко применяемая в настоящее время техника (гл. 4, [11, 26]). Она используется также при изучении живых клеток. Например, маркеры мембран применяются для сорти­ровки живых клеток с помощью проточного цитофлуориметра, который позволяет осуществлять разделение (сортировку) клеток.

Иммунофлуоресценция мелких объектов, например сегментов хромосом, бывает очень слабой, и они могут быть значительно лучше видны при использовании мощного синего света лазе­ра [15]. Недавно созданный метод визуализации слабо флуо­ресцирующих продуктов реакции с помощью лазерной скани­рующей микроскопии описан в разд. 7.

4.4. Двойное окрашивание

Разработка эффективных систем фильтров для возбуждения зеленым и синим светом стимулировала использование двух флуорохромов в одном препарате. В свою очередь использование двойного окрашивания привело к разработке систем вертикальных (опак) иллюминаторов, снабженных встроенной турелью с четырьмя дихроичными зеркалами и запирающими фильтрами, а также револьвером с возбуждающими фильтрами. Для наблюдения клеток после двойного окрашивания существуют специальные иллюминаторы, позволяющие осуществлять од­ним движением полную смену набора фильтров, состоящего из фильтров для возбуждения, запирания и дихроичного зеркала. Примерами двойного окрашивания являются окраска эпителиальных клеток по методу акрифлавин—Фёльген—СИТЦ (АФС) [29] и мечение ФИТЦ- и ТРИТЦ-конъюгатами в одном препарате.