3.4.2. Запирающие фильтры

Фильтры LP-типа пропускают много света в области длин­ных волн (90% или даже больше) и эффективно отсекают свет тех длин, которые короче указанной на оправе фильтра. В ком­бинации с SP-фильтром фильтр LP-типа служит эффективным избирательным фильтром для пропускания флуоресценции. Та­кая комбинация особенно полезна для последовательного на­блюдения двухцветной флуоресценции с минимальным пере­крыванием. Хотя фильтры LP-типа используются в основном как запирающие, однако в комбинации с SP-фильтрами они могут успешно применяться и в качестве возбуждающих. До недавнего времени все LP-фильтры были стеклянными, в на­стоящее время изготавливаются интерференционные фильтры данного типа. Некоторые стеклянные LP-фильтры при очень высоких интенсивностях обнаруживают аутофлуоресценцию, однако при использовании их в качестве запирающих фильт­ров при обычной флуоресцентной микроскопии данной пробле­мы не возникает.

3.4.3. Цветные светоделительные зеркала

СДЗ отражает свет тех длин волн, которые короче указан­ной на зеркале, и пропускает свет с большими длинами волн. Оно располагается под углом 45° к оптической оси и отражает возбуждающий свет в объектив для эпиосвещения, при кото­ром объектив служит конденсором. Вертикальные многоволно­вые осветители выпускаются со скользящими или вращающи­мися гнездами для фильтров, позволяющими проводить эпи-освещение при различных полосах длин волн. В табл. 6.2 при­ведены разнообразные комбинации фильтров для различных длин волн.

3.5. Объективы и окуляры

При эпиосвещении объектив микроскопа служит также и конденсором; таким образом, получающийся результат сильно зависит от выбора объектива. Не все объективы пригодны для флуоресценции, так как для коррекции аберраций изображе­ния они могут иметь множество дополнительных линз. Пригод­ны для наблюдения флуоресценции ахроматы и флюоритовые объективы. При работе в проходящем свете интенсивность на- •блюдаемой флуоресценции пропорциональна квадрату число­вой апертуры (NA) как объектива, так и конденсора, а при ра­боте в падающем свете — четвертой степени апертуры объекти­ва. Яркость связана обратной зависимостью с увеличением объ­ектива. Таким образом, при флуоресцентной микроскопии жела­тельно пользоваться объективами с высокой числовой аперту­рой и умеренным общим увеличением.

4. Применение флуоресцентных красителей

4.1. Нуклеиновые кислоты

Описано очень много способов окрашивания, позволяющих получить флуоресценцию структур, содержащих нуклеиновые кислоты. Вероятно, одним из самых известных флуорохромов для выявления нуклеиновых кислот является акридиновый оранжевый [21, 22]. Механизм реакции окрашивания сложен. Он включает встраивание молекул красителя в нуклеиновую кислоту и электростатическое связывание. Акридиновый оранжевый может быть возбужден синим светом, и тогда ДНК обычно флуоресцирует зеленым,'а РНК — красным светом [23]. Для проточной цитофотометрии часто используют этидиумбро-мид и пропидиумиодид. Оба они дают красную флуоресценцию при возбуждении синим или зеленым (этидиумбромид) и зеле­ным (пропидиумиодид) светом.

Другой, часто используемый для окраски ядра флуорохром — это ДАФИ (4',6'-диамидино-2-фенилиндол). Он легко доступен и выпускается, например фирмой Sigma. ДАФИ ис­пользуется в концентрации 30—1000 нг/мл буфера (0,1 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис, рН 7,0). При возбуждении УФ-све-том (табл. 6.2) с длиной волны около 350 нм ДАФИ, связанный•с ДНК, дает синее свечение с длиной волны около 450 нм. Его можно использовать для окрашивания ядерного материала как in situ, так и при флуоресцентной спектрофотометрии в био­химии [24, 25].

В случае применения для окраски белков ДАФИ дает бело-синюю флуоресценцию при возбуждении УФ-светом. Окрашен­ная ДАФИ цитоплазма ярко флуоресцирует, однако мы наблю­дали быстрое снижение интенсивности свечения при освещении. В то же время окрашенная СИТЦ (стильбенизотиоцианатсульфоновая кислота) цитоплазма также дает при возбуждении УФ-светом синюю флуоресценцию, которая не выцветает в та­кой степени, как свечение после окраски ДАФИ.

Процедуры окрашивания по типу реакции Фёльгена, такие как парарозанилин — Фёльген или акрифлавин — Фёльген, в ос­новном применяются для получения поглощающих свет окрасок. Однако при использовании специально подобранных длин волн возбуждения, окрашенные парарозанилином ядра могут давать достаточно сильную красную флуоресценцию (при возбуждении зеленым светом). Ядра, окрашенные акрифлавином, демонстри­руют при возбуждении синим светом желтую флуоресценцию.